核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途与流程

本公开涉及一种能够抑制前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)基因表达的核酸、药物组合物和sirna缀合物。本公开还涉及该核酸、药物组合物与sirna缀合物的制备方法和用途。

背景技术：

1、血脂异常，尤其是低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)持续偏高是诱发和促进动脉粥样硬化发生、发展的重要危险因素，与缺血性心脑血管疾病密切相关，严重威胁着人类健康。现有的治疗血脂异常的药物主要有他汀类、胆固醇吸收抑制剂、树脂类、普罗步考、贝特类和烟酸及其衍生物。应用降脂药降低血浆胆固醇水平可降低心脑血管疾病的发病风险，但仍有相当比例的患者未达到理想的血脂水平。

2、研究表明，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(pcsk9)基因在脂质代谢、特别是胆固醇代谢中具有重要作用。通过抑制pcsk9基因表达，能够有效降低血浆胆固醇水平。小干扰rna(small interfering rna，sirna)可基于rna干扰(rna interference，rnai)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。若能从mrna层面，抑制pcsk9基因表达，无疑将是最为理想的治疗手段。

3、开发抑制pcsk9基因表达和治疗高胆固醇血症的sirna药物的关键在于寻找合适的sirna及其修饰以及有效的递送系统。

技术实现思路

1、本公开的发明人意外发现，具有本公开提供的如下sirna缀合物能够特异性地抑制pcsk9基因的表达，并且特异性地靶向肝脏，抑制肝脏中pcsk9基因的表达，实现治疗或预防高胆固醇血症。此外，发明人还发明了具有较高活性的sirna和药物组合物。

2、在一些实施方式中，本公开提供了一种sirna缀合物，该缀合物具有如式(308)所示的结构：

3、

4、其中：n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；m1、m2或m3独立地为选自2-10的整数；r10、r11、r12、r13、r14或r15各自独立地为h，或选自于由以下基团所组成的组：c1-c10烷基、c1-c10卤代烷基以及c1-c10烷氧基；

5、r3为式a59所示结构的基团：

6、

7、其中，e1为oh、sh或bh2；

8、nu为sirna，该sirna含有正义链和反义链，所述sirna中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列i，所述反义链含有一段核苷酸序列ii，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii选自如下i)-vi)中的一组：

9、i)所述核苷酸序列i与seq id no:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

10、5'-aagcaagcagacauuuauz1 -3'(seq id no:1)；

11、5'-z2auaaaugucugcuugcuu-3'(seq id no:2)，

12、其中，z1为c，z2为g，所述核苷酸序列i中包含位置对应于z1的核苷酸z3，所述核苷酸序列ii中包含位置对应于z2的核苷酸z4，所述z4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；

13、ii)所述核苷酸序列i与seq id no:61所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:62所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

14、5'-uuuguagcauuuuuauuaz5 -3'(seq id no:61)；

15、5'-z6uaauaaaaaugcuacaaa-3'(seq id no:62)，

16、其中，z5为a，z6为u，所述核苷酸序列i中包含位置对应于z5的核苷酸z7，所述核苷酸序列ii中包含位置对应于z6的核苷酸z8，所述z8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；

17、iii)所述核苷酸序列i与seq id no:121所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:122所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

18、5'-gccuggaguuuauucggaz9 -3'(seq id no:121)；

19、5'-z10uccgaauaaacuccaggc-3'(seq id no:122)，

20、其中，z9为a，z10为u，所述核苷酸序列i中包含位置对应于z9的核苷酸z11，所述核苷酸序列ii中包含位置对应于z10的核苷酸z12，所述z12是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；

21、iv)所述核苷酸序列i与seq id no:181所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:182所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

22、5'-cuguuuugcuuuuguaacz13 -3'(seq id no:181)；

23、5'-z14guuacaaaagcaaaacag-3'(seq id no:182)，

24、其中，z13为u，z14为a，所述核苷酸序列i中包含位置对应于z13的核苷酸z15，所述核苷酸序列ii中包含位置对应于z14的核苷酸z16，所述z16是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；

25、v)所述核苷酸序列i与seq id no:241所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:242所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

26、5'-gguuuuguagcauuuuuaz17 -3'(seq id no:241)；

27、5'-z18uaaaaaugcuacaaaacc-3'(seq id no:242)，

28、其中，z17为u，z18为a，所述核苷酸序列i中包含位置对应于z17的核苷酸z19，所述核苷酸序列ii中包含位置对应于z18的核苷酸z20，所述z20是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；并且，

29、vi)所述核苷酸序列i与seq id no:301所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列ii与seq id no:302所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

30、5'-gugacuuuuuaaaauaaaz21 -3'(seq id no:301)；

31、5'-z22uuuauuuuaaaaagucac-3'(seq id no:302)，

32、其中，z21为a，z22为u，所述核苷酸序列i中包含位置对应于z21的核苷酸z23，所述核苷酸序列ii中包含位置对应于z22的核苷酸z24，所述z24是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；

33、r2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：c(o)、nh、o、s、ch＝n、s(o)2、c2-c10亚烯基、c2-c10亚炔基、c6-c10亚芳基、c3-c18亚杂环基和c5-c10亚杂芳基；并且其中，r2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：c1-c10烷基、c6-c10芳基、c5-c10杂芳基、c1-c10卤代烷基、-oc1-c10烷基、-oc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-oh、-oc1-c10卤代烷基、-sc1-c10烷基、-sc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-sh、-sc1-c10卤代烷基、卤素取代基、-oh、-sh、-nh2、-c1-c10烷基-nh2、-n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-nh(c1-c10烷基)、n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基苯基)、nh(c1-c10烷基苯基)、氰基、硝基、-co2h、-c(o)o(c1-c10烷基)、-con(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-conh(c1-c10烷基)、-conh2、-nhc(o)(c1-c10烷基)、-nhc(o)(苯基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(c1-c10烷基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(苯基)、-c(o)c1-c10烷基、-c(o)c1-c10烷基苯基、-c(o)c1-c10卤代烷基、-oc(o)c1-c10烷基、-so2(c1-c10烷基)、-so2(苯基)、-so2(c1-c10卤代烷基)、-so2nh2、-so2nh(c1-c10烷基)、-so2nh(苯基)、-nhso2(c1-c10烷基)、-nhso2(苯基)和-nhso2(c1-c10卤代烷基)；

34、每个l1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：c(o)、nh、o、s、ch＝n、s(o)2、c2-c10亚烯基、c2-c10亚炔基、c6-c10亚芳基、c3-c18亚杂环基和c5-c10亚杂芳基；并且其中，l1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：c1-c10烷基、c6-c10芳基、c5-c10杂芳基、c1-c10卤代烷基、-oc1-c10烷基、-oc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-oh、-oc1-c10卤代烷基、-sc1-c10烷基、-sc1-c10烷基苯基、-c1-c10烷基-sh、-sc1-c10卤代烷基、卤素取代基、-oh、-sh、-nh2、-c1-c10烷基-nh2、-n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-nh(c1-c10烷基)、n(c1-c10烷基)(c1-c10烷基苯基)、nh(c1-c10烷基苯基)、氰基、硝基、-co2h、-c(o)o(c1-c10烷基)、-con(c1-c10烷基)(c1-c10烷基)、-conh(c1-c10烷基)、-conh2、-nhc(o)(c1-c10烷基)、-nhc(o)(苯基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(c1-c10烷基)、-n(c1-c10烷基)c(o)(苯基)、-c(o)c1-c10烷基、-c(o)c1-c10烷基苯基、-c(o)c1-c10卤烷基、-oc(o)c1-c10烷基、-so2(c1-c10烷基)、-so2(苯基)、-so2(c1-c10卤代烷基)、-so2nh2、-so2nh(c1-c10烷基)、-so2nh(苯基)、-nhso2(c1-c10烷基)、-nhso2(苯基)和-nhso2(c1-c10卤代烷基)；

35、表示基团共价连接的位点；m1表示靶向基团。

36、在一些实施方式中，本公开提供了一种能够抑制pcsk9基因表达的sirna，所述sirna含有正义链和反义链，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸；所述正义链含有一段核苷酸序列i，所述反义链含有一段核苷酸序列ii，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii至少部分地反向互补形成双链区，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列i和核苷酸序列ii中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列i的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列ii的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸，并且，所述核苷酸序列i和所述核苷酸序列ii选自上述i)-vi)中的一组。

37、在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的sirna和药学上可接受的载体。

38、在一些实施方式中，本公开提供了一种sirna缀合物，所述sirna缀合物含有本公开提供的sirna以及缀合连接至该sirna的缀合基团。

39、在一些实施方式中，本公开提供了本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物在制备用于治疗和/或预防由pcsk9基因异常表达引起的疾病或生理状况的药物中的用途。

40、在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防由pcsk9基因异常表达引起的疾病或生理状况的方法，该方法包括将有效量的本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物给予有需要的受试者。

41、在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制肝细胞中pcsk9基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物与所述肝细胞接触。

42、在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的sirna和/或药物组合物和/或sirna缀合物。

43、有益效果

44、本公开提供的sirna、药物组合物和sirna缀合物具有良好的稳定性，较高的pcsk9mrna抑制活性，较低的脱靶效应及毒性，和/或能显著治疗或预防由pcsk9基因异常表达引起的疾病或生理状况，例如，高胆固醇血症。

45、在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体外细胞实验中显示出优异的靶mrna抑制活性。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在肝细胞中显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的靶mrna抑制率。

46、在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物可在体内具有更高的稳定性和/或更高的活性。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体内显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的靶基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体内显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的pcsk9基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体内显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的肝内pcsk9基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体内显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的动物模型中肝内pcsk9基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物在体内显示出至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的人类受试者中肝内pcsk9基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的sirna、药物组合物或sirna缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达。据认为，如果脱靶基因表达的结合/抑制与在靶基因效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。

47、在一些实施方式中，本公开提供的sirna在psicheck系统中显示出较高的抑制活性，对目标序列的ic50在0.0194-0.0561nm之间。在一些实施方式中，本公开提供的sirna缀合物经皮下单次注射食蟹猴，9mg/kg的剂量下，相对于给药前第7天，给药后第15天对nhp肝组织pcsk9 mrna的抑制率达56-81％。在一些实施方式中，本公开提供的sirna缀合物对血清中pcsk9蛋白表达的抑制更为显著，给药后第14天血清中pcsk9蛋白表达的抑制率可达90％以上。在一些实施方式中，本公开提供的sirna缀合物能够显著抑制血清ldl-c和cho水平，尤其在给药后第14天至第29天期间，对ldl-c的抑制率可高达30％以上，甚至高达64％；对cho也有较高的抑制率，甚至可高达35％以上。在一些实施方式中，本公开提供的sirna缀合物单次给药9mg/kg的剂量，对高于50％ ldl-c抑制率可维持11周之久，并且本公开提供的sirna缀合物在大鼠、小鼠中均未发现明显的毒性。综上，本公开提供的sirna缀合物起效快，作用时间长，抑制靶mrna表达显著，能够有效降低血清中pcsk9蛋白含量，对血清中ldl-c和cho有强烈的抑制作用，且生物安全性能良好。

48、由此说明，本公开提供的sirna、药物组合物以及sirna缀合物能够抑制pcsk9基因的表达，有效治疗和/或预防由pcsk9基因异常表达引起的疾病或生理状况，具有良好的应用前景。

49、本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。