一种用于检测猪圆环病毒3型的等温扩增试剂盒

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒3型的等温扩增试剂盒。

背景技术：

1、猪圆环病毒3型可引起猪皮炎与肾病综合征(pdns)，临床表现包括母猪流产、仔猪腹泻和胎儿死亡、皮炎等多种症状，是威胁全球生猪健康养殖的重要病原之一。pcv3混合感染对宿主的影响没有得到准确解释，做好对pcv3的预防工作成为降低该病危害性的关键措施。目前，pcv3的病原检测手段主要包括普通pcr和实时荧光定量pcr方法等。但这些检测技术需要使用较复杂的仪器和设备操作完成，对于地理位置较偏僻、环境较简陋的养殖基地来说很难完成快速、有效的日常检测，而且不能同时鉴别检测2种病原。pcv3自2017年开始，在多地猪场相继出现，造成损失较大，并有加重趋势。随着生猪养殖场疾病防控的需求的逐步增加，为了解决pcv3感染率高且容易与其他病毒发生混合感染的问题，目前急需开发一种快速、准确的鉴别诊断pcv3的产品，对于病毒的预防、控制和净化具有重要意义。

2、在养殖场内临床诊断的第一步为临床体征评估，但由于pcv3感染后常呈现亚临床表现，仅表现为平均日增重下降，或者与其他病原体混合感染产生极为复杂的症状，仅用临床诊断和病理学诊断难以确诊。聚合酶链式反应(pcr)是核酸扩增方法中最常见的一种，其引物设计相对简单，容易应用在不同的病原检测中。但由于其对反应温度和反应仪器的要求，难以应用到现场检测中。相比与pcr，等温扩增方法如环介导等温扩增(lamp)、重组酶聚合酶扩增(rpa)等，因无需复杂的温度控制仪器，在现场检测应用中有着巨大优势。然而，复杂的引物设计限制了它们在检测一些短目标或gc含量异常序列时的应用。以lamp为例，当面对长度小于200bp的片段或gc含量过高过低的片段时，其扩增效率会明显降低，容易造成假阳性。因此，建立一种适用于检测pcv3不同长度和不同gc含量核酸片段的等温扩增方法，在临床快速检测中具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种引物组。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种方法。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种检测系统。

6、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：

7、本发明的第一个方面，提供一种引物组，其特征在于，所述的引物组包括外引物和内引物；

8、所述外引物包含lof与lor：其中，lof的序列如seq id no.2所示，lor的序列如seqid no.3所示；

9、其中，lif的序列如seq id no.4所示，lir的序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7所示。

10、优选地，所述lir的序列如seq id no.7所示。

11、优选地，所述引物组用于检测猪圆环病毒3型；进一步用于检测猪圆环病毒3型的cap基因。

12、优选地，所述cap基因如seq id no.1所示：

13、gctcagcaaacaaaaactatgttcgggcacacagccatagatctagacggcgcctggaccacaaacacttggctccaagacgacccttatgcggaaagttccactcgtaaagttatgacttctaaaaaaaaacacagccgttacttcacccccaaaccaattctggcgggaactaccagcgctcacccaggacaaagcctcttctttttctccagacccaccccatggctcaacacatatgaccccaccgttcaatggggagcactgctttggagcatttatgtcccggaaaaaactggaatgacagacttctacggcaccaaagaagtttggattcgttacaagtccgttctctaa。

14、本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，包括本发明第一个方面的引物组。

15、优选地，所述试剂盒还包含探针。

16、优选地，所述探针包含荧光探针和淬灭探针。

17、优选地，所述荧光探针的序列如seq id no.8所示。

18、优选地，所述淬灭探针的序列如seq id no.9所示。

19、优选地，所述荧光探针的5’端标记有荧光基团。

20、优选地，所述淬灭探针的3’端标记有淬灭基团。

21、优选地，所述荧光基团包括fam、hex中的至少一种。

22、优选地，所述淬灭基团包括bhq1、tamra中的至少一种。

23、优选地，所述试剂盒还包括dntps、dna聚合酶、阳性标准模板、阴性对照质控标准品、反应缓冲液、和水中的至少一种。

24、优选地，所述dna聚合酶包括taq dna聚合酶、bsu dna聚合酶、bst dna聚合酶、koddna聚合酶、phusion dna聚合酶、和t7 dna聚合酶中的至少一种。

25、优选地，所述反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4、和tween20中的至少一种。

26、优选地，所述阳性标准模板包括含有pcv3-cap基因的质粒。

27、优选地，所述阴性对照质控标准品包括不含pcv3-cap基因的质粒。

28、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的引物组和/或本发明第二个方面的试剂盒在非诊断目的的检测猪圆环病毒3型中的应用。

29、优选地，所述检测猪圆环病毒3型为检测猪圆环病毒3型的cap基因(比如：seq idno.1所示的cap基因)。

30、本发明的第四个方面，提供一种非诊断目的的猪圆环病毒3型的检测方法，使用本发明第一个方面的引物组和/或本发明第二个方面的试剂盒对样品进行检测。

31、优选地，所述方法的反应条件为：反应在60-65℃下进行，50s-70s分钟/每个循环，共38-42个循环，在每个循环结束时测量荧光信号。

32、优选地，所述反应条件为：反应在63℃下进行，60s/每个循环，共40个循环，在每个循环结束时测量荧光信号。

33、优选地，所述检测猪圆环病毒3型为检测猪圆环病毒3型的cap基因(比如：seq idno.1所示的cap基因)。

34、本发明的第五个方面，提供一种检测系统。

35、优选地，所述检测系统包括以下构件：

36、1)猪圆环病毒3型的cap基因的检测构件；

37、2)数据处理构件；

38、3)结果输出构件。

39、优选地，所述猪圆环病毒3型的cap基因的检测构件含有本发明第一个方面的引物组和/或本发明第二个方面的试剂盒。

40、优选地，所述检测构件包含检测仪器，所述检测仪器选自荧光定量pcr仪、测序仪中的一种或多种。

41、优选地，所述数据处理构件被配置为：

42、根据检测构件检测的待测样品中猪圆环病毒3型的cap基因的检出与否的结果，判断待测样品中是否含有猪圆环病毒3型。

43、优选地，所述数据处理构件的判断标准为：

44、若待测样品中检出猪圆环病毒3型的cap基因，则待测样品中含有或疑似含有猪圆环病毒3型；

45、若待测样品中未检出猪圆环病毒3型的cap基因，则待测样品中不含有或疑似不含有猪圆环病毒3型。

46、本发明的有益效果是：

47、本发明基于一种适用于检测不同长度和不同gc含量核酸片段的等温扩增方法并简化引物过程的扩增方法-线性置换等温扩增(linear displacementisothermalamplification,ldia)方法；提供了一种猪圆环病毒3型(porcine circovirus3，pcv3)等温扩增检测引物组，包括一对外引物(lof和lor)和内引物(lif和lir)。由于混合物中内引物的浓度高于外引物，则很容易被结合到模板上并随模板扩增。在延长外引物和bst dna聚合酶的链置换活性的帮助下形成单链dna(ssdna)。通过内引物形成短双链dna(dsdna)。在60℃的温度下，这些dna短链(40～120bp)会发生双链dna解旋的过程，即处于一个解离和半解离的状态。随后，lif和lir分别退火到dsdna上并产生新的扩增子。这些dsdna将不断地成为新的模板，并启动循环反应。根据这一原理，在反应中加入cap-lar-fam和cap-lar-bhq1，与lif或lir形成一个更短的产物。本发明的创新点在于简化了pcv3病毒检测的等温扩增的引物，现有技术中以往的等温扩增引物都是需要特殊结构的，而本发明意外发现不需要特殊结构的线性引物，在一定的组合下也可实现等温扩增。

48、本发明提供的引物组能在大幅度降低引物设计难度的同时，保持与其他等温扩增反应如环介导等温扩增方法等相近的敏感性和特异性；可以适用于gc含量更高以及200bp以下的靶标序列。在现场检测，特别是应对复杂核酸序列时具有很好的应用前景。