一种解淀粉芽孢杆菌及其用途的制作方法

本发明涉及生物，具体来说涉及一种解淀粉芽孢杆菌，同时还涉及该解淀粉芽孢杆菌在防治由烟草亚隔孢壳菌属(didymella sp.)、附球菌属(epicoccum sp.)、茎点霉(phoma sp.)、棒孢霉属(corynespora sp.)、葡萄座腔菌(botryosphaeria sp.)、新壳梭孢菌属(neofusicoccum sp.)、黑孢属(nigrospora sp.)、耙齿菌属(irpex sp.)、炭角菌(xylaria sp.)、尾孢菌(cercospora sp.)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)引起病害方面的用途。

背景技术：

1、烟草是我国重要经济作物，在不同生育阶段，其叶部易发生多种真菌性病害。大田期先后出现靶斑病(tobacco target spot)、棒孢霉病害(tobacco corynesporaleafspot)，茎点霉病害(tobaccophoma leafspot)、赤星病(tobacco brown spot)等主要真菌性病害。除上述主要病害外，近几年烟草上还陆续报道了卡斯特炭疽病菌(colletotrichum karstii)、亚隔孢壳菌(diymella segeticola)、附球菌(epicoccumlatusicollum)、炭角菌(xylaria arbuscula)、黑孢菌(nigrospora aurantiaca)、尾孢菌(cercospora nicotianae)等新病原引起的新病害，且多种病害常混合发生。烟叶常从下向上逐层落黄，它们通常先侵染底部脚叶，再逐步向中上部叶片扩展，为害期内有多次侵染循环，常造成烟叶减产、品质下降，严重时损失可达80％以上，威胁着烟草的健康生产与可持续发展，因此对由烟草亚隔孢壳菌属(didymella sp.)、附球菌属(epicoccum sp.)、茎点霉(phoma sp.)、棒孢霉属(corynespora sp.)等引起真菌性病害的防治迫在眉睫。

2、长期以来，生产上主要靠化学防治药剂来防治烟草白粉病、赤星病为主的真菌性病害，主要药剂有苯并咪唑类的多菌灵、三唑酮、代森锰锌、菌核净等。由于真菌性病害具有种类多、病原种群复杂、病原菌繁殖速率高、遗传变异大和适合度高的特性,多年连续大量使用常规化学药剂难以防治烟草白粉病、赤星病等病害，同时国内外已有药剂抗性的报道；许多新出现的病害目前还没有有效防控措施。微生物菌剂可以与病原菌竞争营养、空间位点，诱导植物产生抗病性，其次生代谢产物对病原菌具有抑制作用、对植物具有促生作用，且绿色、环保、安全，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。因此，寻找环境友好的、高效、安全的微生物菌剂，将其用于烟草上多种新型病害的防治具有广阔的发展空间，同时也是农业安全可持续发展的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对由烟草亚隔孢壳菌属、附球菌属、茎点霉、棒孢霉属、葡萄座腔菌、新壳梭孢菌属、黑孢属、耙齿菌属、炭角菌、尾孢菌、立枯丝核菌引起的病害具有较好的防治效果，且有较长时间的预防作用，环境友好的解淀粉芽孢杆菌。

2、本发明的另一目的在于提供该解淀粉芽孢杆菌在防治由烟草亚隔孢壳菌属(didymella sp.)、附球菌属(epicoccum sp.)、茎点霉(phoma sp.)、棒孢霉属(corynespora sp.)、葡萄座腔菌(botryosphaeria sp.)、新壳梭孢菌属(neofusicoccumsp.)、黑孢属(nigrospora sp.)、耙齿菌属(irpex sp.)、炭角菌(xylaria sp.)、尾孢菌(cercospora sp.)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)引起的病害方面的用途。

3、本发明的一种解淀粉芽孢杆菌，其形态特征：在na培养基上培养24小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。

4、该菌种已于2013年8月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏号：cctccno：m 2013375，名称为：解淀粉芽孢杆菌x60(bacillusamyloliquefaciens x60)，

5、(一)解淀粉芽孢杆菌x60(bacillus amyloliquefaciens x60)的分离步骤：

6、采用“稀释分离法”称取10g烟草根围土壤于洁净烧杯中，加于90ml无菌水，磁力搅拌使其充分混匀，静置20分钟后吸取0.5ml上清液于15×150mm洁净试管中，添加4.5ml无菌水充分混匀得10-1浓度母液，再从稀释后的试管中吸取0.5ml上清液，再加入4.5ml无菌水充分混匀制得10-2浓度溶液，依次稀释至10-9不同浓度的土壤溶液待用。分别吸取上述不同浓度土壤溶液100μl，均匀涂布于培养细菌的na平板上，28℃黑暗培养，待细菌长出后挑取单菌落纯化。

7、(二)培养基：

8、牛肉膏蛋白胨固体培养基(na)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂粉16g，水1000ml，ph6.8～7.2。

9、牛肉膏蛋白胨液体培养基(nb)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，ph 6.8～7.2。

10、(三)菌种的保种和传代：

11、用18×180mm的试管，盛na培养基9ml，做成斜面，接种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。

12、将纯化后的细菌在na培养基上划线培养，待细菌长出后挑出单菌落，用灭菌的牙签将细菌单菌落挑至装有5mlnb培养基的试管(15×150mm)里摇培24h，吸取700μl菌液至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700μl 30％灭菌甘油，置于-20℃冰柜中长期保存。

13、(四)菌种的性态特征：

14、该菌形成的菌落在na平板上，30℃，培养2d，菌落直径5～15mm，菌落近圆形、白色、半透明、光滑湿润、稍隆起，菌体为短直杆状，为好氧细菌，革兰氏反应阳性。经细菌鉴定手册描述，结合biolog鉴定结果及16s rdna序列分析结果，将这一菌株记为解淀粉芽孢杆菌x60(bacillus amyloliquefaciensx60)。

15、(五)菌种的培养特性

16、培养温度20～50℃，最适温度范围30～37℃；培养初始ph4.0～9.0，最适6.0～7.0；培养盐浓度0.5～5％，最佳0.5％；可培养碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、纤维二塘、淀粉，其中葡萄糖最佳；可培养氮源有牛肉膏、蛋白胨、kno3、nh4no3、(nh4)2so4和nano2，其中牛肉膏和蛋白胨最佳。

17、本发明的解淀粉芽孢杆菌在防治由烟草亚隔孢壳菌属(didymella sp.)、附球菌属(epicoccum sp.)、茎点霉(phoma sp.)、棒孢霉属(corynespora sp.)、葡萄座腔菌(botryosphaeria sp.)、新壳梭孢菌属(neofusicoccum sp.)、黑孢属(nigrospora sp.)、耙齿菌属(irpex sp.)、炭角菌(xylaria sp.)、尾孢菌(cercospora sp.)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)引起的病害方面的用途。

18、本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明经离体试验表明，解淀粉芽孢杆菌菌株x60对烟草亚隔孢壳菌、附球菌、茎点霉、棒孢霉、葡萄座腔菌、新壳梭孢菌、黑孢菌、耙齿菌、炭角菌、尾孢菌、立枯丝核菌的菌丝生长均具有很强的抑制作用。活体实验表明：该菌剂能够显著降低由以上真菌性病原引起的烟草病害的发生，并具有较长时间的预防作用。具有同化学杀菌剂氟啶胺相当的防治效果。该菌剂用湿菌与菌种保藏液配制而成，菌体保藏液为0.01mol/l磷酸盐缓冲液、及0.001mol/l的tween40非离子型表面活性剂。该菌剂可以直接喷雾活体烟叶。由于是微生物菌剂，对环境友好，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于无公害生产、有机生产。