核酸分子及其作为特异启动子的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及核酸分子及其作为特异启动子的应用。

背景技术：

1、启动子(promoter)是位于结构基因5'端上游的一段dna序列，能活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性。按照其作用方式及功能可分为三类：组成型启动子、组织特异型启动子以及诱导型启动子。组成型启动子在多数或全部组织中有持续表达外源基因的活性，一般常用于外源基因的广泛表达。组织特异性启动子往往能够限制基因只在某些特定的组织或器官中表达，同时表现出发育调节等特性。因而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体细胞/组织中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果，因此人们对特异性启动子的研究和应用越来越重视。

2、基因治疗(genetherapy)是指将外源正常基因通过基因转移技术导入靶细胞，以纠正或代偿基因缺陷和异常引起的疾病，最终达到治疗目的的一种生物治疗方法。遗传性视网膜疾病(ird)是一组由遗传因素引起的视网膜疾病的统称。该类疾病可由与视网膜病理学相关的300余种不同的基因突变引起，这些基因的正确表达对于光感受器(pr)和视网膜色素上皮(rpe)功能而言至关重要。一旦这些基因不能正确表达，就会导致进行性的细胞死亡从而使患者失明。对于该类遗传疾病而言，最理想、最有效的治疗方式莫过于通过基因增强、编辑或沉默等技术纠正致病基因。

3、虽然目前可以通过原位注射、组织特异性血清型aav递送等方法将特定外源基因递送至目标细胞附近，但是仍然很难避免感染其他非靶向组织或细胞。此时便需要特异性启动子来特定控制外源基因的表达，进一步降低外源基因在非靶向组织或细胞中的表达，进而降低对其他正常组织器官的影响。

4、aav的基因组容量约为4.7kb，包装递送基因的长度有限，因此大多数情况需要使用长度偏短的启动子来驱动外源基因的表达。为了达到更好的治疗效果，使用的启动子最好是pr或rpe层细胞中特异表达的启动子。此外还需要考虑启动子表达强度的问题，因此结合三个方面的考虑，几乎难以找到合适的启动子序列作为外源基因表达的启动子。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了核酸分子及其作为特异启动子的应用。本发明通过人工改造获得的重组启动子能够在眼睛的视网膜结构细胞中特异性表达外源基因，降低了在非靶向细胞中的表达，可以降低对其他正常组织器官的影响。本发明提供的重组启动子的长度都不超过500bp，适用于在aav载体中表达较大外源基因的需求，应用范围较广。本发明提供的部分启动子在pr细胞中表达强度较高，在某些对目的基因表达量要求较高的场景下也适用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了核酸分子，其具有：

4、(1)、如seq id no:1～seq id no:9任意所示的核苷酸序列；或

5、(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或

6、(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。

7、在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子，其具有：

8、(1)、如seq id no:1～seq id no:9任意所示的核苷酸序列；或

9、(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或

10、(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的核苷酸序列。

11、在本发明的一些实施方案中，seq id no:1的序列为：gccctaatcatcaattagcagagccggtgaaggcccctgggagaccggggctgacacagcaccaggctaaatcccagccggggtcacggaggacgcttaggagtggcaagaaggtgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatcattctgcccggccccttcctccaaggggccgcctcacttttcccctgagaaggacaaacaaccaccaggcttctggggcccaa。(retinae11)

12、在本发明的一些实施方案中，seq id no:2的序列为：cctggccactaatctgtgatcacttatccgttgcctttgtgtatttggaatggatatccaaccattggattttcatttttgcagagaacaagaatagggttgggaggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggattgtcttcctctccctcttgaccgagattccccttctgtctagagggagataagcaactctgaggccattcagaggattgtggatataagaggctgggaggccagcccgggcagagcagagggcgctgacattgggatatcaagactgtaccgagtagggggcggccccttggaggaaggggccgggcagaatgatctaatcggattccaagcagctcaggggaatgaagcgatcgc。(retina2a11)

13、在本发明的一些实施方案中，seq id no:3的序列为：ccctttttgacttctgaccttcctacctcgttcactaatctgttttccaaactcttggccctttgtatagaaaagttgagaggcaggccgagtttgaggccagcctggtctacacaggcgttctaggagaacctgtctcccggccccttcctccaaggggccgcctcacttttcccctggttgctaagctggagaccgggccctgtcgagggttcctggggaccactgggaagcccctgggagaccggggctgacacagcaccaggctaaatcccagccggggtcacggaggcagcaccaggctaaatcccagccggggtcacggaggacgcttaggagtggcaagaaggtgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatcattctgcccgg。(retinab3)

14、在本发明的一些实施方案中，seq id no:4的序列为：tagaaaaagacaatcccctgagctgcttgagggctaacagaagatcaagtcccattttagcctccctagctctggcctacctcctcagttagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatccctggctcatctctcaggatgcctatcttgtccttagcacgatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtggctagaaaaagacaatccccgcctggcccggatcacttatccgttgcctttgtgtatttggaggctgggaggccagctgccccagaagcctggtggttgtttgtccttctcaggggatgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgatta。(retinac8)

15、在本发明的一些实施方案中，seq id no:5的序列为：cccaggggcttcccagtggtccccaggaaccctcgacaggctggcctgtgggatcagcccgggcctcttcaccttaaaagctcccaaaccccctccagctctggttgctaagctggcctaggagtggcaagaaggtgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatcattctgcccggccccttcctccaaggggccggacagagtgtgtgcagagagactgactgtgtgtgcttcttcccattccggaggtggcagaggtgggacataaacacagagagggccccttgctggacgagagagaccgggccctgtcgagacttatacgttgcctttgtgtatttggaatggatatccaaccattggattttcatttttgtgtggttaaacatcatttgttccctttttgacttctgaccttcc。(retinad9)

16、在本发明的一些实施方案中，seq id no:6的序列为：cacagcaccaggctaaatcccagccggggtcacggaggacgcttaggagtggcaagaaggtgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatcattctgcccgg。(retinaa12)

17、在本发明的一些实施方案中，seq id no:7的序列为：cctacagcagccagggtgagattacatgaaacggaagctctgtcctcatgaaacacccatgccctttccccacccctcagcctcctgcacccacccttctattcctatgcatttgggagctctgagtgcaatcctacgggcaagaaggtgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatcattctgcccggccccttcctccaaggggccgcctcacttttccgtggatataagaggctgggaggcc。(retinab4)

18、在本发明的一些实施方案中，seq id no:8的序列为：tgtgagatagaggaaaaggaaaaatatgttaggatagagtaacattctcttcttcccgtaaaagctgggcgagagtgcggaccggtggtgcttgcctaccttgccttgagactccttacccgagctggagagctccttcctaatccggggattgtcccctaaatctgatctgctagtaggtcacagagagctgacagatgaggtgggttccgtgtctgtgaaattccgattctcctgcttccgctttcc。(reti nal02)

19、在本发明的一些实施方案中，seq id no:9的序列为：acaagtccaacatctaatcttccaccctggccagggccccagctggcagcgagggtgggagactccgggcagagcagagggcgctgacattggggcccggcctggcttgggtccctctggcctttccccagcctatcttgtccttagcacgatgaggaggaggcctggcctccagctctggttgacggaggacgcttaggagtggcaagaaggtgctagaaaaagacaatcccctgagctgcttggaatccgattagatcattctgggaggaggcctgg。(retinaa2)

20、在本发明的一些实施方案中，上述核酸分子的大小不大于500bp。

21、本发明还提供了上述核酸分子作为启动子的应用。

22、本发明还提供了重组表达载体，包括：上述核酸分子和目的基因。

23、在本发明的一些实施方案中，上述重组表达载体，还包括：荧光蛋白。

24、在本发明的一些实施方案中，上述重组表达载体中，所述荧光蛋白包括入核绿色荧光蛋白和/或入核红色荧光蛋白。

25、在本发明的一些实施方案中，上述重组表达载体中，所述入核绿色荧光蛋白包括：nls-egfp。

26、在本发明的一些实施方案中，上述重组表达载体中，所述入核红色荧光蛋白包括：nls-mcherry。

27、本发明还提供了上述重组表达载体的构建方法，取所述核酸分子和所述目的基因连接后，获得所述重组表达载体。

28、本发明还提供了病毒颗粒，转化和/或转染上述重组表达载体和/或上述构建方法获得的重组表达载体。

29、本发明还提供了上述病毒颗粒的制备方法，取所述重组表达载体进行病毒包装后，收毒，纯化，获得所述病毒颗粒。

30、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述细胞包括：293t细胞。

31、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述病毒包括aav。

32、在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中，所述纯化采用氯化铯。

33、本发明还提供了上述核酸分子、上述重组表达载体、上述构建方法获得的重组表达载体、上述慢病毒颗粒和/或上述制备方法获得的病毒颗粒在特异性表达视网膜结构的细胞中的应用。

34、在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述视网膜结构包括：光感受器和/或视网膜色素上皮

35、本发明还提供了上述核酸分子、上述重组表达载体、上述构建方法获得的重组表达载体、上述病毒颗粒和/或上述制备方法获得的病毒颗粒在制备治疗和/或预防遗传性视网膜疾病的产品中的应用。

36、本发明还提供了产品，包括：上述核酸分子、上述重组表达载体、上述构建方法获得的重组表达载体、上述病毒颗粒和/或上述构建方法获得的病毒颗粒。

37、本发明提供了核酸分子，其具有：

38、(1)、如seq id no:1～seq id no:9任意所示的核苷酸序列；或

39、(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列；或

40、(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸序列。

41、本发明的有益效果包括：

42、(1)、本发明通过人工改造获得的重组启动子能够在眼睛的视网膜结构细胞中特异性表达外源基因，降低了在非靶向细胞中的表达，可以降低对其他正常组织器官的影响。

43、(2)、本发明提供的重组启动子的长度都不超过500bp，适用于在aav载体中表达较大外源基因的需求，应用范围较广。

44、(3)、本发明提供的部分启动子在pr细胞中表达强度较高，在某些对目的基因表达量要求较高的场景下也适用。