神经特异性敲除PIWIL1基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用

本发明涉及动物模型，且特别涉及一种神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用。

背景技术：

1、目前，阿尔茨海默症、帕金森综合症等神经疾病的发病率在我国成逐年上升的趋势。每年在这一类神经疾病中所花费的治疗费用大大的加重了社会的经济负担。但如今对于这类疾病的诊断机制和治疗手段并没有得到很好的明确。因此，深入探索神经性疾病的发病机制有利于临床优化神经性疾病患者个体化精准治疗。

2、piwi样rna介导的沉蛋白1（piwi-like rna-mediated gene silencing 1），又称piwil1，位于人类5号染色体，包含了22个外显子。2000年首次在果蝇的生殖细胞中被发现。在生殖细胞中，piwil1蛋白可以结合pirna，在精子发生过程中调控基因表达，并保护染色体免受dna损伤和突变。近年来的研究发现piwil1蛋白对大脑神经的发育，以及神经疾病的产生都有着千丝万缕的关系。

3、crispr-cas9技术在生物工程和生物医学方面有广泛的应用。可以快速建立基因突变的动物模型和细胞模型，用于探究遗传变异与疾病之间的关系。然而，在现有的基因敲入小鼠库中尚未发现有神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠及其与神经性疾病相关的研究和报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，利用crispr/cas9技术构建神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠模型，从而可为神经疾病的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。

2、本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

3、本发明提出一种构建神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型的特异性靶向rna，所述特异性靶向rna包括guide-rna 1、guide-rna 2、guide-rna 3和guide-rna 4，所述guide-rna 1的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述guide-rna 2的核苷酸序列如seqid no：2所示，所述guide-rna 3的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述guide-rna 4的核苷酸序列如seq id no：4所示，其中，所述guide-rna 1和所述guide-rna 2作用于piwil1基因的intron 4靶序列，所述guide-rna 3和所述guide-rna 4作用于所述piwil1基因的intron 7靶序列，所述intron 4靶序列如seq id no：5所示，所述intron 7靶序列如seq idno：6所示。

4、本发明提出一种神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：

5、s1、根据piwil1基因的结构确定敲除flox exon 5-7（flox区域约1.6kb），并针对所述piwil1基因的intron 4和intron 7设计特异性靶向rna；

6、s2、将有活性的所述特异性靶向rna和cas9质粒体外转录成mrna，得到sgrna和cas9 mrna，然后通过显微镜注射将所述sgrna、所述cas9 mrna以及含有loxp位点的donordna片段注射到小鼠受精卵中；

7、s3、将所述小鼠受精卵移植到代孕母鼠体内，从后代中筛选得到flox阳性的杂合子小鼠（f/+）；

8、s4、选择能够在大脑皮层特异性表达cre酶的emx1-cre小鼠与所述flox阳性的杂合子小鼠（f/+）进行交配，经基因型鉴定，得到神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型，即（f/f，e-cre）纯合子敲除鼠，记为p-cko。

9、进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述基因型鉴定采用短片段pcr方法，所述短片段pcr方法的引物包括cre-forward、cre-reverse、piwi-forward和piwi-reverse，所述cre-forward的核苷酸序列如seq id no：7所示，所述cre-reverse的核苷酸序列如seqid no：8所示，所述piwi-forward的核苷酸序列如seq id no：9所示，所述piwi-reverse的核苷酸序列如seq id no：10所示。

10、进一步地，在本发明的较佳实施例中，采用电泳的方式对pcr扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5%的琼脂糖凝胶, 在 120v，80a的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。

11、进一步地，在本发明的较佳实施例中，所述采用电泳的方式对pcr扩增的产物进行鉴定为：若为一条300bp的条带，为cre阳性，cre阴性则无任何条带；若为一条450bp的条带，为野生型小鼠（+/+），若为450bp和500bp两条带，为杂合子小鼠（f/+），若为一条500bp的条带，则为纯合子小鼠（f/f）。

12、本发明提供一种神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型，其根据上述的构建方法构建得到。本发明采用crispr/cas9基因敲除技术构建得到神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型。该cre阳性的小鼠在大脑皮层被特异性敲除了 piwil1基因，为神经疾病的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型，因此其对探索神经性疾病的发病机制和治疗有着重要的意义。

13、本发明提供所述的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型在抑郁症或神经退行性疾病研究中的应用。

14、本发明提供所述的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型在制备和筛选防治抑郁症的药物和分子靶标中的应用。

15、本发明提供所述的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型在制备和筛选防治神经退行性疾病的药物和分子靶标中的应用。

16、本发明实施例的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用的有益效果是：

17、本发明基于crispr/cas9基因敲除技术设计神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型的特异性靶向rna，并成功构建得到神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型。本发明首次构建了神经特异性piwil1基因的小鼠敲除模型，在研究神经性疾病分子机理方面具有较高的应用价值，可作为筛选研究防治抑郁症以及神经退行性疾病的药物以及诊断的分子靶标的动物模型。该动物模型简单稳定、周期短，为能贴合临床进行分期并且符合临床疾病进展的动物模型。

技术特征：

1. 一种构建神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型的特异性靶向rna，其特征在于，所述特异性靶向rna包括guide-rna 1、guide-rna 2、guide-rna 3和guide-rna 4，所述guide-rna 1的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述guide-rna 2的核苷酸序列如seqid no：2所示，所述guide-rna 3的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述guide-rna 4的核苷酸序列如seq id no：4所示，其中，所述guide-rna 1和所述guide-rna 2作用于piwil1基因的intron 4靶序列，所述guide-rna 3和所述guide-rna 4作用于所述piwil1基因的intron 7靶序列，所述intron 4靶序列如seq id no：5所示，所述intron 7靶序列如seq idno：6所示。

2.一种神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定采用短片段pcr方法，所述短片段pcr方法的引物包括cre-forward、cre-reverse、piwi-forward和piwi-reverse，所述cre-forward的核苷酸序列如seq id no：7所示，所述cre-reverse的核苷酸序列如seq id no：8所示，所述piwi-forward的核苷酸序列如seq id no：9所示，所述piwi-reverse的核苷酸序列如seq id no：10所示。

4. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用电泳的方式对pcr扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5%的琼脂糖凝胶, 在120v，80a的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述采用电泳的方式对pcr扩增的产物进行鉴定为：若为一条300bp的条带，为cre阳性，cre阴性则无任何条带；若为一条450bp的条带，为野生型小鼠（+/+），若为450bp和500bp两条带，为杂合子小鼠（f/+），若为一条500bp的条带，则为纯合子小鼠（f/f）。

6.一种神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型，其特征在于，根据权利要求1~5任意一项所述的构建方法构建得到。

7.如权利要求6所述的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型在抑郁症或神经退行性疾病研究中的应用。

8.如权利要求6所述的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型在制备和筛选防治抑郁症的药物和分子靶标中的应用。

9.如权利要求6所述的神经特异性敲除piwil1基因突变小鼠动物模型在制备和筛选防治神经退行性疾病的药物和分子靶标中的应用。

技术总结
本发明提供一种神经特异性敲除PIWIL1基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，该方法包括：利用CRISPR/Cas9技术，针对目的基因的基因结构寻找靶序列，以及设计针对该位点的guide‑RNA；经活性检测后，将具有活性的guide‑RNA和Cas9体外转录；最后将guide‑RNA、Cas9 mRNA以及含有loxP位点的donor DNA片段注射到受精卵中，从后代中筛选获得目的exon被flox的阳性小鼠。本发明首次构建了神经特异性PIWIL1基因的小鼠敲除模型，在研究神经性疾病分子机理方面具有较高的应用价值，可作为筛选研究防治抑郁症以及神经退行性疾病的药物以及诊断的分子靶标的动物模型。该动物模型简单稳定、周期短，为能贴合临床进行分期并且符合临床疾病进展的动物模型。

技术研发人员：苗楠,潘贤,孙涛
受保护的技术使用者：华侨大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4