检测草莓细菌性冠腐病的方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种检测草莓细菌性冠腐病的方法。

背景技术：

1、草莓病虫危害多发易发，仅常发性重要病虫害就有灰霉病、白粉病、炭疽病和朱砂叶螨、棕榈蓟马、蚜虫等10余种。近年来，由于草莓种苗省际调运频繁，草莓生产上出现一种影响种植的杀手病害“草莓细菌性冠腐病”。发病初期，植株心叶皱缩脱水，花萼片生长无力、脱水，发病中后期，植物萎蔫，纵向剖开短缩茎，可见短缩茎呈现水渍状褐化现象，横向剖开，可见短缩茎出现塌陷和空洞，茎部轻掰易折断，如图3所示。

2、草莓细菌性冠腐病和草莓角斑病常容易混淆，仅靠田间症状难以区分。常规的选择性分离技术，需要进行纯培养和生化鉴定等多个步骤，检测周期长，灵敏性低，不能实现大批量植物组织的快速检测，且通常要花费3天以上时间。近年来发展的pcr技术虽能提高检测效率,但是需要专用pcr仪和专业操作人员和电泳观测结果，在基层农业部门难以大规模推广应用。lamp技术是2000年notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在bst dna聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件lh内可以进行特异高效快速的核酸扩增，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。lamp方法与pcr技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性,操作简单。

3、草莓经济价值高，莓农为保证丰产用药不惜成本，草莓细菌性病害已经上升为制约草莓健康持续发展和安全生产的重大风险隐患，因此迫切需要一种高效、便捷的病原检测方法，以帮助农民及时采取控制措施，减少产量损失。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供用于检测荧光假单胞菌的试剂在草莓细菌性冠腐病检测中的应用，以解决上述问题中的至少一种。

2、本发明的第二目的在于提供检测草莓细菌性冠腐病的引物，其特异性好，灵敏度高。

3、本发明的第三目的在于提供一种检测草莓细菌性冠腐病的试剂盒。

4、本发明的第四目的在于提供一种检测草莓细菌性冠腐病的方法。

5、为了实现以上目的，提出以下方案：

6、第一方面，本发明提供了用于检测荧光假单胞菌的试剂在草莓细菌性冠腐病检测中的应用。

7、作为进一步技术方案，所述草莓细菌性冠腐病由荧光假单胞菌所导致。

8、第二方面，本发明提供了检测草莓细菌性冠腐病的引物，所述引物包括上游内引物fip、下游内引物bip、环引物lf和环引物lb；

9、所述上游内引物fip的序列如seq id no.1所示；

10、所述下游内引物bip的序列如seq id no.2所示；

11、所述环引物lf的序列如seq id no.3所示；

12、所述环引物lb的序列如seq id no.4所示。

13、作为进一步技术方案，还包括上游外引物f3和下游外引物b3；

14、所述上游外引物f3的序列如seq id no.5所示；

15、所述下游外引物b3的序列如seq id no.6所示。

16、第三方面，本发明提供了一种检测草莓细菌性冠腐病的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物。

17、作为进一步技术方案，所述试剂盒还包括缓冲液、变色指示剂、解旋酶、mg2+、dntp和bst聚合酶。

18、作为进一步技术方案，所述变色指示剂包括l-hnb变色指示剂；

19、所述bst聚合酶包括bst 4.2dna/rna聚合酶。

20、第四方面，本发明提供了一种检测草莓细菌性冠腐病的方法，包括：采用所述的引物或者所述的试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增。

21、作为进一步技术方案，所述环介导等温扩增的反应体系中，上游内引物fip和下游内引物bip的浓度为8-16μm；

22、和/或，所述环引物lf和环引物lb的浓度为4-8μm；

23、和/或，所述环介导等温扩增的反应体系中还包括上游外引物f3和下游外引物b3，所述上游外引物f3和下游外引物b3的浓度为2-4μm。

24、作为进一步技术方案，所述环介导等温扩增的温度为65-70℃，时间为30-60min。

25、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

26、经发明人研究发现，草莓细菌性冠腐病是由荧光假单胞菌所导致的，通过检测荧光假单胞菌能够实现对草莓细菌性冠腐病的鉴定。

27、本发明提供的引物，能够特异性识别荧光假单胞菌的基因；本发明提供的检测方法以该引物对待测样品进行环介导等温扩增，能够实现对草莓细菌性冠腐病的检测，解决了生产上草莓角斑病和草莓细菌性冠腐病难以区分的问题，该检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好和检测时间短的优点，操作过程简单，不需要pcr仪和电泳仪，比其他pcr技术具有更高的特异性，特别适合农业部门和企业自检使用。

技术特征：

1.用于检测荧光假单胞菌的试剂在草莓细菌性冠腐病检测中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草莓细菌性冠腐病由荧光假单胞菌所导致。

3.检测草莓细菌性冠腐病的引物，其特征在于，所述引物包括上游内引物fip、下游内引物bip、环引物lf和环引物lb；

4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，还包括上游外引物f3和下游外引物b3；

5.一种检测草莓细菌性冠腐病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述的引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、变色指示剂、解旋酶、mg2+、dntp和bst聚合酶。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述变色指示剂包括l-hnb变色指示剂；

8.一种检测草莓细菌性冠腐病的方法，其特征在于，包括：采用权利要求3或4所述的引物或者权利要求5-7任一项所述的试剂盒对待测样品进行环介导等温扩增。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应体系中，上游内引物fip和下游内引物bip的浓度为8-16μm；

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的温度为65-70℃，时间为30-60min。

技术总结
本发明提供了一种检测草莓细菌性冠腐病的方法，涉及生物技术领域。经发明人研究发现，草莓细菌性冠腐病是由荧光假单胞菌所导致的，通过检测荧光假单胞菌能够实现对草莓细菌性冠腐病的鉴定。本发明提供的引物，能够特异性识别荧光假单胞菌的基因；本发明提供的检测方法以该引物对待测样品进行环介导等温扩增，能够实现对草莓细菌性冠腐病的检测，解决了生产上草莓角斑病和草莓细菌性冠腐病难以区分的问题，该检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好和检测时间短的优点，操作过程简单，不需要PCR仪和电泳仪，比其他PCR技术具有更高的特异性，特别适合农业部门和企业自检使用。

技术研发人员：冯晓晓,彭一文,翟婧,王蒙岑,许燎原,郑永利
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21