一种基于核酶耦合辣根过氧化物酶的可视化核酸检测方法

本发明涉及核酸检测领域，具体是一种基于mg2+依赖型的dnazyme特异性识别目标核酸，并能直接肉眼观察信号的方法。

背景技术：

1、核酸检测(nat，nucleic acid test)具有高度的特异性和敏感性，在分子诊断领域发挥着重要作用，特别是在传染病、肿瘤、癌症生物标记物、基因突变和基因分型方面，还有助于食品安全控制和环境监测。与免疫检测和微生物培养等其他方法相比，nat具有许多显著的优势，包括高水平的灵敏度和特异性，以及较短的操作等待时间。

2、大多数核酸检测策略，如pcr(polymerase chain reaction)、northern、southern和聚丙烯酰胺凝胶电泳，都需要繁琐的实验程序、昂贵和复杂的设备，这些可能是许多实验室无法获得的。例如，pcr需要三种不同的热循环、电泳后处理或荧光标记，虽然常规的聚合酶链式反应筛查是实验室检测的金标准，但聚合酶链式反应需要严格而复杂的温度控制，增加了仪器的成本。

3、除了pcr是实验室传统检测核酸的标准之外，目前还发展了等温扩增例如环介导等温扩增、核酸序列扩增、重组酶聚合酶扩增、解旋酶依赖扩增、等温滚环扩增，这些方法灵敏度和准确性和聚合酶链式反应相当，但也需要在配备专业诊断仪器的大型实验室中进行。

4、基于以上分析，开发一种灵敏度高、简便、低成本的精准检测核酸的方法对于相关领域有重大意义。dnazyme是一种由一条或多条dna组成的核酸结构，其中特定部位也包含一个或几个rna碱基，具有类似蛋白酶的自我催化功能，能在恒温条件下自身切割裂解。依赖mg2+裂解催化的dnazyme具有特异性好、序列简单易合成等优点，在核酸检测领域应用广泛。纳米颗粒具有比表面积高、生物相容性优良、易于分离等特点，而辣根过氧化物酶灵敏度非常高，且不易受干扰，常用于免疫分析，两者非常适合核酸检测领域。本发明将dnazyme的自催化裂解反应与辣根过氧化物酶以及磁分离技术结合，实现了超高灵敏度和高特异性的核酸可视化检测。

技术实现思路

1、为了克服现有的核酸检测技术存在的操作繁琐、成本高、需要高度专业人员等缺点，本发明提供了一种基于核酶耦合辣根过氧化物酶的可视化核酸检测方法，该方案中的dnazyme能被特定的核酸序列开启反应，将底物链裂解，释放含有催化功能的hrp酶，不需要借助任何精密仪器以及专业人员操作，直接观察到颜色信号。dnazyme结构中的左、右两条序列和底物链、耦合体中的hs-dna杂交，当体系中引入待检测靶标核酸时，dnazyme发生自我催化裂解反应；由于底物链5’端经过生物素化修饰，借助链霉亲和素的分离作用，将释放的hrp-aunps-dna耦合体能直接催化tmb由无色转变成蓝色，实现简便快捷的检测。本方案具有特异性强、灵敏度高、恒温无需扩增等特点，能实现极低浓度核酸的定性和半定量检测，在临床疾病中特殊的生物标志物检测具有广阔的应用前景。

2、一种基于核酶耦合辣根过氧化物酶的可视化核酸检测方法，具体方案如下：

3、(6)选定一种依赖mg2+而裂解催化的dnazyme，设计序列使其能与目标dna特异性匹配。

4、(7)使用标准的纳米金颗粒溶液，使其和hs-dna连接，然后在其表面附着辣根过氧化物酶(hrp)，制备hrp-dna耦合体。

5、(8)将底物链、链霉亲和素修饰的磁珠及hrp-dna耦合体三者共同孵育一段时间，充分杂交。

6、(9)将靶标序列、dnazyme左、dnazyme右、mg2+以及第三步中杂交后的体系混合，引发dnazyme的自我催化裂解，从而释放出含hrp的片段。

7、(10)使用磁性棒将磁珠黏附的部分序列同裂解片段分离开，取上清液用于tmb溶液显色，无需借助任何仪器目视即可观察到信号。

8、以下内容是对上述方案中技术路线的补充：

9、靶标dna序列(5’-3’)为ugagguaguagguuguauaguu，设计的dnazyme序列包含此条靶标序列；dnazyme1的序列(5’-3’)为ctccttgttgacgttacacccatgttactctc,dnazyme2的序列(5’-3’)为tgatatcagcgattaaccctggagggtag，底物链的序列(5’-3’)为gagagtataggatatcatttagaccatcctggcta acacggtgaaacccc，此条序列其中第九个碱基为核糖核苷酸，其余为脱氧核糖核苷酸。

10、本方案使用的纳米金颗粒溶液(2.2nm，购买于中科雷鸣)，直径为15nm，先进行10倍浓缩处理，终浓度为22nm，ph调至6.5；hs-dna浓度为37.5μm，所用体积为20μl；hrp溶液是将20mg粉末状hrp加入156μldepc水溶解而成的，浓度为0.0025mol/l。制备的条件为hrp-aunps-dna的条件为：40μl浓度为22nm的aunps溶液中加入64μl 0.0025mol/l的hrp溶液，在4℃下混合2h；加入75μl hs-dna和10μl 1mm tcep-hcl，4℃下反应24h；加入20μl质量分数为1％的sds，室温下摇动孵育1h；加入40μl 20mm nacl溶液，在4℃反应24h；在高速离心机12000rpm下离心15min，弃掉上清液中未结合上aunps的hrp酶，重复离心一次；加入0.01mpbs洗涤两次，离心，分散在制备好的保护液体系中；其中保护液体积为100μl，由25μl 20mmna3po4·12h2o、25μl质量分数5％的bsa、25μl体积分数为0.25％的吐温、25μl质量分数10％的蔗糖组成。

11、取链霉亲和素修饰的磁珠(购买于上海mce公司，货号hy-k0208-5ml)20μl、底物链6μl、已制备好的hrp-aunps-dna溶液6μl三者混合，在4℃下反应2h，磁性分离弃掉少量上清液，再次均匀混合。取12μl上述溶液、4μl dnazyme左、4μl dnazyme右、4μl靶标序列、2μl1mm的mgcl2溶液、5μl1mm的nacl溶液、5μl hepes buffer，混合均匀，25℃下反应1h。反应结束后利用磁性分离，吸取上清液20μl，与tmb溶液混合，观察到无色的tmb溶液立即转变成蓝色。使用酶标仪测量吸光度，设置波长为370nm。

12、一种基于核酶耦合辣根过氧化物酶的可视化核酸检测方法与现有技术相比，其有益效果是：

13、(1)hrp酶催化信号放大。hrp酶催化tmb显色反应具有痕量触发、反应程度深、灵敏度高等优点，极少量酶即可使无色tmb立即转变成蓝色，无需借助任何专业仪器，目视可判断有无信号。

14、(2)靶标核酸的高度特异性识别。特定序列的dna和rna需要分别与dnazyme左、dnazyme右两条序列的上半部分碱基互补配对，两条探针共同识别才能触发裂解反应保证了此方案的高度特异性。

15、(3)磁性分离、操作简便、快速。dnazyme识别靶标核酸可在20min内高效进行，磁性分离借助磁性铁棒即可，靶标核酸可视化过程能在短短30秒内完成。

16、(4)恒温无扩增。本方案中dnazyme识别目标核酸的过程和tmb催化显色均可以在常温下稳定进行；且不需要繁琐耗时的核酸扩增步骤，省时省步骤。