一种利用A-PRF预处理提升人间充质干细胞功能的方法与流程

本发明涉及一种提升人间充质干细胞功能的方法，特别是涉及一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，属于提升人间充质干细胞功能的方法。

背景技术：

1、近年来，研究者通过对人间充质干细胞进行基因修饰或进行预处理方式不断努力尝试提升mscs的治疗效果，而体外基因修饰过的mscs仍处于早期研究阶段，想要应用于临床疾病治疗困难重重。而mscs的预处理主要是利用化学或物理方式对mscs进行体外处理，以期维持和增强mscs黏附、增殖、存活能力，减少细胞衰老等。此外，预处理也可以改善mscs与先天/适应性免疫系统的相互作用，mscs预处理的形式具有更好的临床应用潜能。

2、改良型富白细胞和血小板富纤维蛋白是新一代血小板浓缩物，由于a-prf富含白细胞以及多种细胞因子，理论上能够刺激mscs的生长，促进分泌功能，进而提升其临床疾病治疗效果。a-prf用于mscs预处理促进其治疗功能的研究偶有可见，其中涉及的共培养方法为间接法，即将prf凝胶块浸泡于完全培养基中15-28天不等，之后用浸泡后的培养基再用于mscs的培养，然后再进行后续的功能评估实验。这样的方法非常的耗时，体系完成时长长达一个月且不稳定，时间人力成本高，为此本专利设计一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法来解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是为了提供一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法。采用a-prf分离实验进行人供体a-prf的提取，进行hmscsa-prf共培养体系建立，37℃情况下5％co2细胞培养箱内每24h进行a-prf形态观察，摇匀培养基，持续培养72h，丢弃细胞培养小室，检测下层人间充质干细胞状态及功能。通过上述共培养体系，利用a-prf预处理的人间充质干细胞，与未处理进行对比，细胞形态和表面标志物未见明显变化，但细胞增殖速率明显加快，凋亡不变。在同等培养时间条件下，该共培养体系可在短期内明显促进细胞增殖，从而在后续利用间充质干细胞进行治疗时，提升疗效。

2、本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

3、一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，包括如下步骤：

4、步骤一：采用a-prf分离实验进行人供体a-prf的提取；

5、步骤二：进行hmscsa-prf共培养体系建立；

6、步骤三：37℃情况下5％co2细胞培养箱内每24h进行a-prf形态观察，摇匀培养基；

7、步骤四：持续培养72h，丢弃细胞培养小室，检测下层人间充质干细胞状态及功能。

8、优选的，在步骤一进行人供体a-prf的提取具体包括如下步骤：

9、s11：采用一次性采血针经肘正中静脉采集5ml/管；

10、s12：血液于采血管中于1min内迅速转移至离心机，1500rpm常温离心14min，小心取出后室温静置10min；

11、s13：于无菌操作台内打开管盖，用无菌镊拖出中间层凝胶与血块置于无菌容器内，以无菌剪初步将凝胶与血块分离，快速用剪刀将多余的血块剪去。

12、优选的，在步骤二中具体建立培养体系包括如下步骤：

13、s21：以6×105个细胞/孔密度接种hmscs于6孔板内，加入1.5ml完全培养基，静置8h后，将0.4μm孔径的细胞培养小室置入孔内，此时，小室下层为贴壁培养的人间充质干细胞；

14、s22：小室上层内放入新鲜分离并剪成0.5cm3小块儿的a-prf，并加入1ml完全培养基，建立共培养体系。

15、优选的，在步骤四中对下层人间充质干细胞状态及功能的检测，具体采用倒置显微镜观察并记录细胞状态，流式细胞仪对mscs进行表型分析，检测其表面标志物的表达情况。用分化试剂盒检测间充质干细胞成脂、成骨的分化潜能。通过细胞消化计数、edu染色定量统计、细胞周期染色试剂盒检测间充质干细胞的增殖能力。通过利用流式细胞仪pi/annexinv双荧光染色检测细胞凋亡。

16、优选的，在s21中采用的完全培养基包括基础培养基、血清、碳酸氢钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸、细胞因子和葡萄糖。

17、本发明的有益技术效果：

18、本发明提供的一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，采用a-prf分离实验进行人供体a-prf的提取，进行hmscsa-prf共培养体系建立，37℃情况下5％co2细胞培养箱内每24h进行a-prf形态观察，摇匀培养基，持续培养72h，丢弃细胞培养小室，检测下层人间充质干细胞状态及功能。通过上述共培养体系，利用a-prf预处理的人间充质干细胞，与未处理进行对比，细胞形态和表面标志物未见明显变化，但细胞增殖速率明显加快，凋亡不变，在同等培养时间条件下，该共培养体系可在短期内明显促进细胞增殖，从而在后续利用间充质干细胞进行治疗时，提升疗效。

技术特征：

1.一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，其特征在于：在步骤一进行人供体a-prf的提取具体包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，其特征在于：在步骤二中具体建立培养体系包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，其特征在于：在步骤四中对下层人间充质干细胞状态及功能的检测，具体采用倒置显微镜观察并记录细胞状态，流式细胞仪对mscs进行表型分析，检测其表面标志物的表达情况。用分化试剂盒检测间充质干细胞成脂、成骨的分化潜能。通过细胞消化计数、edu染色定量统计、细胞周期染色试剂盒检测间充质干细胞的增殖能力。通过利用流式细胞仪pi/annexin v双荧光染色检测细胞凋亡。

5.根据权利要求4所述的一种利用a-prf预处理提升人间充质干细胞功能的方法，其特征在于：在s21中采用的完全培养基包括基础培养基dmem、血清、碳酸氢钠、谷氨酰胺、非必需氨基酸、细胞因子和葡萄糖。

技术总结
本发明公开了一种利用A‑PRF预处理提升人间充质干细胞功能的方法，属于提升人间充质干细胞功能的方法技术领域，采用A‑PRF分离实验进行人供体A‑PRF的提取，进行hMSCs<supgt;A‑PRF</supgt;共培养体系建立，37℃情况下5％CO<subgt;2</subgt;细胞培养箱内每24h进行A‑PRF形态观察，摇匀培养基，持续培养72h，丢弃细胞培养小室，检测下层人间充质干细胞状态及功能，通过上述共培养体系，利用A‑PRF预处理的人间充质干细胞，与未处理进行对比，细胞形态和表面标志物未见明显变化，但细胞增殖速率明显加快，凋亡不变，在同等培养时间条件下，该共培养体系可在短期内明显促进细胞增殖，从而在后续利用间充质干细胞进行治疗时，提升疗效。

技术研发人员：冯健琦,郭筱璐,房瑞,吴梦叶,彭延文
受保护的技术使用者：深圳市前海蛇口自贸区医院（深圳市南山区蛇口人民医院）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21