酿酒酵母代谢工程菌株从头合成东莨菪亭的方法

本发明属于生物工程，具体涉及酿酒酵母代谢工程菌株从头合成东莨菪亭的方法。

背景技术：

1、东莨菪亭(scopoletin)，又称东莨菪内酯，化学名为7-羟基-6-甲氧基香豆素，东莨菪亭作为一种天然香豆素，广泛存在于各种植物中，对人体健康起着重要作用。

2、目前研究发现，东莨菪亭具有很好的抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病、抗凝血、解热、镇痛的作用，因此东莨菪亭在保健、饮食、医疗方面具有很大的前景。东莨菪亭是植物次生代谢物的主要组成部分，具有防御病原菌的作用。目前香豆素的制备方法主要是通过从植物中提取，考虑到经济以及环境效益，通过合成生物学的技术生产东莨菪亭是一种可替代的方法。

3、工业上生产东莨菪亭主要采用植物提取法，尽管有许多植物能够生产东莨菪亭，但植物的生产受到资源以及环境的影响，以及提取过程水污染的影响，大量生产东莨菪亭，仍面临较多困难。合成生物学为工业上生产东莨菪亭提供了新的思路，即利用合成生物学设计和构建微生物细胞工厂。迄今，在酿酒酵母中利用葡萄糖从头合成东莨菪亭未有报道。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种酿酒酵母代谢工程菌株从头合成东莨菪亭的方法。

2、具体的技术方案如下：

3、一种酿酒酵母代谢工程菌株从头合成东莨菪亭的方法，包括如下步骤：

4、1)从p42h-spcas9扩增cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母cen.pk2-1c中的ix-1基因组位点，由此产生的菌株c00；

5、2)葡萄糖从头合成对香豆酸途径的构建：通过步骤1)的菌株c00依次构建c01菌株和c02菌株，发酵产香豆酸；

6、3)对香豆酸至咖啡酸生物合成途径的构建：以c02菌株为基础构建c0201菌株，发酵产咖啡酸；

7、4)通过增加咖啡酸模块拷贝数以增加咖啡酸的产量：将c0201菌株的hpabc基因拷贝数增加至三个，构建c0203菌株，发酵增产咖啡酸；

8、5)咖啡酸至阿魏酸生物合成途径的构建：在c0203菌株中导入阿魏酸合成基因后，构建fa01菌株，发酵产阿魏酸；

9、6)葡萄糖从头合成东莨菪亭途径的构建：引入东莨菪亭合成模块，构建菌株sp01，利用葡萄糖合成东莨菪亭。

10、进一步地，步骤2)的具体操作过程如下：以已构建的质粒ph1-atpal2和质粒ph2-atc4h为模板，分别pcr扩增得到gpm1p-atpal2-adh1t和gpdp-atc4h-cyc1t的表达盒，通过反向pcr构建grna质粒，通过liac/ssdna/peg转化法将等量的线性化片段与grna共转化入酿酒酵母细胞中，通过crispr/cas9技术将两个表达盒插入c00菌株的xii2位点，得到菌株c01，后继在菌株c01基础上在xi3位点分别引入p450还原酶atatr2，并过表达酿酒酵母天然细胞色素cyb5，表达盒(adh1t-cyb5-pgk1p)-

11、(hxt7p-atatr2-cyc1t)从质粒puc19-atcpr2-cyb5上pcr扩增获得，通过反向pcr构建grna，通过liac/ssdna/peg转化法将等量的线性化片段与grna共转化入酿酒酵母细胞中，通过crispr/cas9技术将表达盒插入c01菌株的xi3位点，得到菌株c02，在c02菌株中成功构建苯丙氨酸l-phe到对香豆酸pa的生物合成途径，并发酵产对香豆酸。

12、进一步地，步骤3)的具体操作过程如下：以prs425-ptef1-pahpab质粒为模板，pcr扩增出tef1p-pahpab-tef1t表达盒；以prs425-ppgk1-sehpac质粒为模板，通过pcr扩增出pgk1p-sehpac-hxt7t表达盒；由于两个表达盒之间含有互补序列，再以扩增后的hpab表达盒和hpac表达盒为模板，通过融合pcr扩增出(tef1p-pahpab-tef1t)-(pgk1p-sehpac-hxt7t)表达盒，通过反向pcr构建grna，通过liac/ssdna/peg转化法将等量的线性化片段与grna共转化入酿酒酵母细胞中，通过crispr/cas9技术在c02菌株的x-2位点引入4-羟基苯乙酸3-单加氧酶paohpab和nad(p)h黄素还原酶cosehpac得到菌株c0201，发酵产咖啡酸。

13、进一步地，步骤4)的具体操作过程为：通过从构建好的质粒prs425-paohpac-paohpab上pcr扩增得到(eno2p-paohpac-pgk1t)-(tpip-paohpab-tpi1t)的表达盒，该表达盒与先前构建的表达盒(tef1p-pahpab-tef1t)-(pgk1p-sehpac-hxt7t)之间含有500bp长度的同源臂，两个同源臂共转化入酵母细胞后可在细胞内重组，随后共同导入xii5位点，通过反向pcr构建grna，通过liac/ssdna/peg转化法将等量的线性化片段与grna共转化入酿酒酵母细胞中，通过crsipr/cas9技术将2个拷贝的hpabc基因插入c0201菌株的xii5位点，得到的含有3个拷贝数hpabc基因的c0203，发酵增产咖啡酸。

14、进一步地，步骤5)的具体操作过程为：利用构建好的质粒prs425-atcomt1为模板，通过pcr扩增得到gpdp-atcomt1-cyc1t的表达盒，通过反向pcr构建grna质粒，通过liac/ssdna/peg转化法将等量的线性化片段与grna共转化入酿酒酵母细胞中，通过crispr/cas9技术将gpdp-atcomt1-cyc1t导入酿酒酵母c0203基因组的x3位点，，得到工程菌株fa01，发酵产阿魏酸。

15、进一步地，步骤6)的具体操作过程为：通过bamhⅰ和xholⅰ限制性内切酶分别切割质粒puc57-atf6'h1和prs425-atnomt得到酶切后的阿魏酰辅酶a6’-羟化酶atf6’h1基因以及prs425线性化质粒，将酶切后的片段在t4dna连接酶的作用下16℃过夜连接，将构建好的质粒转化入大肠杆菌dh5α以克隆质粒，得到质粒prs425-atf6’h1，以质粒prs425-atf6’h1为模板pcr扩增得到表达盒tef1p-atf6’h1-tef1t，以已构建质粒ph6-at4cl1为模板pcr扩增得到表达盒pgk1p-at4cl1-hxt7t，将两个表达盒共转化入酿酒酵母后自发重组，通过反向pcr构建grna质粒，通过liac/ssdna/peg转化法将等量的线性化片段与grna共转化入酿酒酵母细胞中，通过crispr/cas9技术将tef1p-atf6’h1和pgk1p-at4cl1-hxt7t表达盒导入酿酒酵母fa01基因组的x4位点，构建菌株sp01，利用葡萄糖合成东莨菪亭。

16、本发明的有益效果在于：本发明利用合成生物学构建微生物细胞从头合成东莨菪亭，可以克服植物提取法上的原料供应、季节限制、环境污染等诸多问题，具有很好的推广应用前景。