一种用于检测猫杯状病毒的单克隆抗体对、杂交瘤细胞株及应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，具体的，本发明涉及一种用于检测猫杯状病毒的单克隆抗体对、杂交瘤细胞株及应用。

背景技术：

1、猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)属于杯状病毒科，杯状病毒属成员。fcv是一种单股正链rna病毒，病毒粒子为立体对称性结构，没有囊膜，容易发生遗传突变和抗原变异。fcv在猫科动物中具有较高的感染性和传播性，没有明显的季节性，冬季发病率比夏季略高，主要通过接触含感染性的患猫口、鼻分泌物、带毒环境进行传播。猫杯状病毒感染主要引起口腔、上呼吸道症状，表现为发热(39.5～42℃)、食欲下降、精神沉郁，口腔出现溃疡、牙龈红肿，眼部分泌物增多，鼻部有分泌物、打喷嚏，严重时发生肺部感染。

2、fcv最早于1957年被fastier分离得到，之后陆续在全球各地相继被发现。fcv只有一个血清型，不同的变异株之间病毒的毒力有一定差异性，抗原性具有交叉性。近年来，有高致病性的fcv毒株(vsd-fcv)在一些国家相继爆发，该毒株可引起感染猫全身性多系统病变，死亡率较高。fcv作为高变异性的rna病毒，其流行毒株的监测，变异毒株的鉴定在其遗传进化分析方面起到重要意义。

3、疫苗接种是防治本病最有效方法，但是由于毒株之间同源性仅有70-80％，因此现有疫苗保护性不高，尤其对具有高致死率的fcv-vsd毒株没有保护性，并且fcv变异性强，变异株的频繁出现也是免疫失败的一大因素。猫杯状病毒病主要采用对症疗法、支持疗法进行治疗，病毒干扰素、广谱抗生素是临床治疗中常使用的药物，干扰素能够抑制病毒的增殖、感染，广谱抗生素可以预防继发性细菌感染，但是缺少针对fcv的特异性治疗制剂。因此，控制本病的根本措施在于免疫预防和检疫。

4、基于fcv变异性强，疫苗保护性不高的情况，早期诊断、及时预防就尤为重要。因此制备一种特异性强、覆盖面广的猫杯状病毒单克隆抗体对该疾病诊断和预防均具有重要意义。

技术实现思路

1、为了提高对猫杯状病毒检测的敏感性和特异性，并建立快速检测猫杯状病毒的方法，为了填补现有技术的缺陷，本发明提供一种用于检测猫杯状病毒的单克隆抗体对、杂交瘤细胞株及应用。具体的，本发明提供如下技术方案：

2、本发明的第一个方面，提供一对产生猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中一株杂交瘤细胞株保藏名称为fcv-13#，保藏号为cgmccno.45746，保藏日为2023年11月21日，另一株杂交瘤细胞株保藏名称为fcv-11#，保藏号为cgmcc no.45747，保藏日为2023年11月21日。

3、本发明的第二个方面，提供一种猫杯状病毒的单克隆抗体对，所述单克隆抗体对由单克隆抗体fcv-13和fcv-11组成，其中，单克隆抗体fcv-13由杂交瘤细胞株fcv-13#产生，单克隆抗体fcv-11由杂交瘤细胞株fcv-11#产生。

4、在一种实施方式中，所述单克隆抗体fcv-13为检测抗体，单克隆抗体fcv-11为捕获抗体，或所述单克隆抗体fcv-13为捕获抗体，单克隆抗体fcv-11为检测抗体。

5、在一种优选的实施方式中，所述单克隆抗体fcv-11作为检测抗体，所述单克隆抗体fcv-11为捕获抗体。

6、本发明的第三个方面，提供一种上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体对在制备用于检测猫杯状病毒的产品中的应用。

7、在一种实施方式中，所述产品为制剂、试剂盒和/或试纸条。

8、本发明的第四个方面，提供一种用于检测猫杯状病毒的试纸条，所述试纸条由如下成分组成：样品垫、胶体金垫、吸水滤纸、硝酸纤维素膜；所述硝酸纤维素膜上包被单克隆抗体fcv-11，所述胶体金垫上包被胶体金标记的单克隆抗体fcv-13；或所述硝酸纤维素膜上包被单克隆抗体fcv-13，所述胶体金垫上包被胶体金标记的单克隆抗体fcv-11。

9、本发明的第五个方面，提供一种制备上述试纸条的方法，所述方法包括以下步骤：

10、(1)金标结合物的制备

11、将胶体金溶液置于搅拌器上，转速300g/min搅拌，用0.2mol/l碳酸钾溶液调节ph值至8.5，逐滴缓慢加入单克隆抗体fcv-13或fcv-11，使其终浓度为8～12μg/ml，室温静置；将加入单抗的胶体金溶液中加入10％的bsa溶液使其终浓度为1％，混匀后封闭30分钟或过夜，7500r/min离心20分钟，弃上清，用金标缓冲液将离心的沉淀重悬，使其体积为原体积1/10，即为金标结合物；

12、(2)金标结合垫的制备

13、每1ml胶体金离心得到的金标结合物加入300μl金标抗原重悬液，混匀，喷涂在玻璃纤维膜上，置于37℃鼓风干燥箱中5小时，烘干后，将金标结合垫切割成长条；

14、(3)硝酸纤维素膜的包被

15、将fcv-11或fcv-13用膜包被液稀释，喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线；将羊抗鼠igg用膜包被液稀释，按照1.0μg/cm喷于硝酸纤维素膜上检测线下5mm处，作为质控线；将包被好的硝酸纤维素膜37℃干燥3小时后，密封保存。

16、相对于现有技术，本发明具有如下显著的进步：

17、我们对筛选获得的具有良好亲和力的3株fcv单克隆抗体进行交叉配对实验，进一步筛选出以fcv-11单克隆抗体作为检测抗体，fcv-13单克隆抗体为捕获抗体的最优配对方式。本发明提供的抗体对与猫杯状病毒具有良好的结合能力，将其应用于猫杯状病毒的检测时，该抗体对能与引起猫常见临床疾病其他病毒不发生阳性反应，同时当病毒稀释至103.0/tcid50/0.1ml时依旧能够检测出阳性，表现出优秀的特异性和灵敏度，可作为胶体金试纸中的检测抗体和捕获抗体使用，具有特异型好、灵敏性高、稳定性好等优势，从而建立快速检测猫杯状病毒的方法，填补了fcv胶体金检测试纸的空缺，对于预防和控制猫杯状病毒流行具有重要意义。

技术特征：

1.一对产生猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其中一株杂交瘤细胞株保藏名称为fcv-13#，保藏号为cgmccno.45746，保藏日为2023年11月21日，另一株杂交瘤细胞株保藏名称为fcv-11#，保藏号为cgmcc no.45747，保藏日为2023年11月21日。

2.一种猫杯状病毒的单克隆抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体对由单克隆抗体fcv-13和fcv-11组成，其中，单克隆抗体fcv-13由权利要求1所述的杂交瘤细胞株fcv-13#产生，单克隆抗体fcv-11由权利要求1所述的杂交瘤细胞株fcv-11#产生。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体fcv-13为检测抗体，单克隆抗体fcv-11为捕获抗体，或所述单克隆抗体fcv-13为捕获抗体，单克隆抗体fcv-11为检测抗体。

4.如权利要求2或3所述的单克隆抗体对，其特征在于，所述单克隆抗体fcv-11作为检测抗体，所述单克隆抗体fcv-13为捕获抗体。

5.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2-4任一所述的的猫杯状病毒的单克隆抗体对在制备用于检测猫杯状病毒的产品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为制剂、试剂盒和/或试纸条。

7.一种用于检测猫杯状病毒的试纸条，其特征在于，所述试纸条由如下成分组成：样品垫、胶体金垫、吸水滤纸、硝酸纤维素膜；所述硝酸纤维素膜上包被权利要求2所述的单克隆抗体fcv-11，所述胶体金垫上包被胶体金标记的权利要求2所述的单克隆抗体fcv-13；或所述硝酸纤维素膜上包被权利要求2所述的单克隆抗体fcv-13，所述胶体金垫上包被胶体金标记的权利要求2所述的单克隆抗体fcv-11。

8.一种制备如权利要求7所述的试纸条的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

技术总结
本发明提供一对用于检测猫杯状病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用，具体的，本发明提供一对杂交瘤细胞株，其中一株杂交瘤细胞株保藏名称为FCV‑13#，保藏号为CGMCC NO.45746，保藏日为2023年11月21日，另一株杂交瘤细胞株保藏名称为FCV‑11#，保藏号为CGMCC NO.45747，保藏日为2023年11月21日。进一步的，本发明提供该对杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体对，及其在检测猫杯状病毒中的应用。所述检测用单克隆抗体对灵敏度高，特异性好，可准确快速地检测猫杯状病毒，具有广阔的应用前景。

技术研发人员：夏振强,金宏丽,石晶,刘迪,赵雪,王倩,付玉,汪玉彬,刘伟
受保护的技术使用者：长春西诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12