一种嗜肺军团菌相关抗原的mRNA疫苗及其制备方法与用途

本发明属于生物医药，具体涉及一种嗜肺军团菌相关抗原的mrna疫苗及其制备方法与用途。

背景技术：

1、军团菌病(legionnaires'diseases ld)是由军团菌(legionella)属细菌引起的感染，病死率高达10％。军团菌病是一种被低估的疾病，自1977年初首次发现以来，一直保持着较高的发病率。而军团菌广泛存在于自然界，可通过空气中含军团菌的气溶胶进行传播。其中，常见的传染源包括水源和土壤。当前，军团菌主要经由空调系统播散，由于空调的广泛应用，军团菌病已然成为全世界的一个公共卫生问题。

2、根据2007年世界卫生组织指南，军团菌感染导致的疾病可分成三种亚型：肺炎性军团菌病、肺外综合征、庞蒂亚克热。目前世界上共发现了71种军团菌，其中至少有19种是人类肺炎的病原体，而引起疾病的主要是嗜肺军团菌(legionella pneumophila,lp)(占病例的91.5％)。研究表明，具有较强免疫原性的lp蛋白，以及能够产生一定浓度体液和细胞免疫反应的dna/蛋白疫苗靶点均有可能成为治疗军团菌的候选靶点。这些靶点主要包括外膜蛋白(momps)、鞭毛蛋白(flaa)、iv型菌毛蛋白(pile)、肽聚糖相关脂蛋白(pal)等。

3、目前，军团菌病的治疗主要以敏感抗生素抗感染治疗为主，支持治疗为辅，并根据患者的临床状况进行一些对症处理。治疗的难点在于严重病例可能延误治疗时机，因此早发现，及早抗感染治疗是关键。尽管抗感染治疗对大多数人有效，但是具有基础疾病的老年嗜肺军团菌感染者约有30％将进入重症监护室，约15-20％死亡。而且，截至目前，尚无可以预防军团菌病的疫苗。因此，军团菌疫苗的研发迫在眉睫。而相对传统疫苗，mrna疫苗因具有快捷高效安全的优势而成为新兴传染病预防性疫苗开发的首选策略。综上可见，开发军团菌mrna疫苗在军团菌病的防治方面具有重要的应用前景。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明基于嗜肺军团菌特异有效抗原，制备了用于嗜肺军团菌相关疾病的核酸分子及其lnp(脂质体纳米颗粒)，该mrna或lnp可以编码具有较强免疫原性的pal，和/或pile，和/或flaa、和/或momps，只需要低剂量即可有效激活机体的体液免疫，起到预防或杀伤嗜肺军团菌的效果。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供了一种编码嗜肺军团菌抗原的核酸分子，所述核酸分子包括编码嗜肺军团菌相关抗原肽聚糖相关脂蛋白pal(编码基因pal)，和/或iv型菌毛蛋白pile(编码基因pile)，和/或鞭毛蛋白flaa(编码基因flaa)，和/或主要外膜蛋白momps(编码基因momps)的核苷酸。

4、所述核酸分子包含5’-帽结构、5’-utr、3’-聚核苷酸序列以及3’-utr中的至少一种。其中，5’-utr为10-200个核苷酸，优选的50-100个核苷酸；3’-utr为50-120个核苷酸；3’-聚核苷酸序列为超过28+80个“a”，进一步优选为30+85个“a”。

5、优选地，所述核酸分子包括seq id no：1所示的mrna、seq id no：2所示的mrna、seq id no：3所示的mrna、seq id no：4所示的mrna中的至少一种。

6、其中，编码flaa的核苷酸的具体序列为在flaa(28-205aa)关键抗原结构序列的n端额外加入来自pal基因的分泌信号肽序列“mkagsfyklgllvasavlvaa”或其它能够增强flaa表达的序列，以显著提高flaa的抗原表达水平。

7、本发明第二方面提供了一种核酸-脂质体复合物，所述核酸-脂质体复合物包括第一方面所述的核酸分子，以及将核酸分子包封在脂质壳中的阳离子脂质纳米颗粒，所述阳离子脂质纳米颗粒包括可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。

8、优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的摩尔比为1：1-10：1。

9、优选地，按摩尔百分比计，所述阳离子脂质纳米颗粒包括20-49％可质子化的阳离子脂质、35-50％结构脂质、5-15％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。

10、优选地，所述结构脂质包括胆固醇及其衍生物，所述辅助脂质包括dspc、dope、dopg、dops，所述聚乙二醇化脂质包括peg-dmg、peg-dspe。所述可质子化的阳离子脂质选自来源于专利cn202111017566.1中的阳离子脂质。

11、更优选地，所述结构脂质为胆固醇，所述辅助脂质为dspc，所述聚乙二醇化脂质为peg-dmg。

12、本发明第三方面提供了第二方面所述核酸-脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：

13、s1、将可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质溶于有机溶剂中，得到有机相；

14、s2、将核酸分子溶于无机盐缓冲液中，得到水相；

15、s3、将有机相和水相充分混匀后得到混合液，替换混合液中的缓冲体系及有机相中的溶剂后得到核酸-脂质体复合物。

16、优选地，所述有机相中可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的总浓度为10-30mg/ml，所述水相中核酸分子的浓度为0.1-1.0mg/ml，所述有机相和水相的体积比为1：2-6。

17、更优选地，所述有机相中可质子化的阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的总浓度为15-20mg/ml，所述水相中核酸分子的浓度为0.25-0.5mg/ml，有机相和水相的体积比为1：3。

18、优选地，所述有机溶剂包括(但不限于)乙醇，所述水相的缓冲液包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐溶液、甘氨酸溶液。

19、优选地，替换混合液中的溶媒缓冲液及有机相中的溶剂的方法为：采用缓冲液将混合液稀释10-200倍，优选总稀释倍数不低于100倍，再浓缩至所需浓度。

20、本发明第四方面提供了第一方面所述的核酸分子，和/或第二方面所述的核酸-脂质体复合物在制备防治军团菌感染的药物中的应用。

21、本发明提供的mrna或lnp(脂质体纳米颗粒)具有良好的免疫原性，可以有效诱导机体产生免疫反应，激活体液免疫和细胞免疫，使机体产生特异性抗体中和嗜肺军团菌。而且，该核酸分子及其脂质纳米颗粒只需要较低剂量即可激活机体的体液免疫，产生军团菌特异igg抗体，对防治军团菌病具有良好效果。

22、优选地，所述防治军团菌感染的药物包括(但不限于)预防肺炎性军团菌病、肺外综合征、庞蒂亚克热的疫苗。

23、本发明利用mrna和新型lnp(脂质体纳米颗粒)技术联合开发的一种疫苗，以mrna作为疫苗的主要成分，制备工艺简单，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白；以mrna作为疫苗的主要成分，具有研发快速、易产业化等优点；使用小剂量的多价疫苗即能达到足够的保护效果，具有良好的安全性、有效性。

24、更优选地，疫苗给药途径包括(但不限于)雾化给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、眼部给药。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、本发明公开了一种能有效预防军团菌感染的核酸分子及其脂质纳米颗粒。其中，该核酸分子可编码表达嗜肺军团菌相关抗原pal、和/或pile、和/或flaa、和/或momps。而且，该核酸分子及其脂质纳米颗粒具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，将该核酸分子及其脂质纳米颗粒递送至体内后能够在机体内表达pal、和/或pile、和/或flaa、和/或momps蛋白，触发机体的免疫反应，能够使机体产生抗体中和军团菌。同时，该核酸分子及其脂质纳米颗粒只需要低剂量即可有效激活机体的体液免疫，分泌大量军团菌相关抗原特异的igg，可以较好地达到预防军团菌感染的效果。此外，该核酸分子或其脂质纳米颗粒制备快速简便，可在短期内实现大规模生产，有利于快速应对预防嗜肺军团菌引起的相关感染性疾病。特别是以该核酸分子(mrna)及其脂质体纳米颗粒)作为主要成分用于开发疫苗，无需使用细胞增殖病毒或生产重组蛋白，具有研发快速、易产业化等优点；使用小剂量的多价疫苗即能达到足够的保护效果，具有良好的安全性、有效性。