表达mIL-15的HER2靶向CAR-NK细胞的制备及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及表达mil-15的her2靶向car-nk细胞的制备及其应用。

背景技术：

1、自然杀伤(nk)细胞是在人体免疫系统中发挥重要作用的效应细胞，由于其无需抗原预先致敏即可发挥细胞杀伤效应而得名，nk细胞约占总外周血单个核细胞的10％左右，主要分布于淋巴结、骨髓、脾脏、肝脏、肠管上皮及肺上皮中。nk细胞主要通过释放穿孔素和颗粒酶，以及分泌细胞因子ifn-γ、tnf-α、gm-csf来发挥细胞毒作用和免疫调节作用。目前对nk细胞进行基因修饰主要有细胞因子修饰以及car基因修饰，其中通过car基因修饰可以增强nk细胞靶向识别和杀伤肿瘤的效果。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)技术是指通过基因工程的手段在免疫效应细胞表面表达一种人为构建的能识别特定肿瘤细胞表面抗原，并能通过其胞内段的信号转导激活结构域活化免疫细胞，发挥免疫细胞杀伤作用的一种新兴的细胞治疗技术。

2、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2，her2)是一种由her2基因编码的酪氨酸激酶受体膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体家族成员之一。研究发现，人类多种肿瘤的发生都与her2原癌基因扩增和her2蛋白的过表达有关，如乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌等，其中约有20-30％乳腺癌患者和10-30％胃癌患者过表达her2基因，因此使用靶向药物进行治疗可以取得良好的疗效。目前，her2靶向药物有很多，主要包括单克隆抗体药物(曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)，在单克隆抗体上发展的adc类药物(恩美曲妥珠单抗)，小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物(拉帕替尼和来那替尼)等。虽然这些药物对her2阳性疾病患者的预后有了显著改善，但是会产生获得性耐药性，肿瘤也会再次复发并进一步恶化。

3、因此，需要研究出以her2为靶点的其他抗肿瘤策略。目前对nk细胞进行的基因修饰主要有细胞因子修饰以及car基因修饰，其中通过car基因修饰可以增强nk细胞靶向识别和杀伤肿瘤的效果，这将为肿瘤患者的治疗提供更好的解决方案。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种膜结合型il-15(mil-15)，所述膜结合型il-15能更好的与细胞自身的il-15受体(il15rβγ)结合，从而激活il-15受体下游信号通路，促进car-nk细胞的自我增殖，同时避免了分泌型il-15带来的细胞因子毒性。

2、具体地，本发明提供了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种膜结合型il-15(mil-15)，所述膜结合型il-15含有il-15核心序列、铰链区和跨膜区。

4、优选地，所述铰链区(hinge)的氨基酸序列与seq id no.15所示至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。或相对于seq id no.15存在1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代，例如保守取代。

5、优选地，所述铰链区的氨基酸序列如seq id no.15所示。

6、优选地，所述跨膜区(tm，transmembrane)的氨基酸序列与seq id no.17具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。或相对于seq id no.17存在1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代，例如保守取代。

7、优选地，所述跨膜区的氨基酸序列如seq id no.17所示。

8、优选地，所述il-15是包括任意来源的il-15，优选为人基因组中的il-15。

9、优选地，所述il-15是指人基因组中的il-15。

10、优选地，所述il-15核心序列的氨基酸序列与seq id no.13具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性。或相对于seq id no.13存在1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代，例如保守取代。

11、优选地，所述il-15核心序列的氨基酸序列如seq id no.13所示。

12、也即，所述膜结合型il-15的完整结构具有seq id no.13-15-17相连所示氨基酸序列。

13、另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有car和上述膜结合型il-15(mil-15)。

14、本发明中所述融合蛋白也称为car-mil15，在具体实施例中也称为car27，具体可以指car和mil-15所连接成的融合蛋白。

15、具体地，在所述融合蛋白中，所述膜结合型il-15可以连接在任意car的n端或c端，期间可以通过任意序列连接。

16、优选地，所述融合蛋白的结构是第一信号肽-car-自裂解序列-第二信号肽-膜结合型il-15的结构依次连接所构成。

17、优选地，第一信号肽与第二信号肽相同或不相同。

18、优选地，所述第一信号肽和第二信号肽，各自独立地，选自任意分泌性蛋白n端的5-30个氨基酸。

19、优选地，所述第一信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

20、优选地，所述第二信号肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

21、优选地，所述自裂解序列具体例如自裂解多肽2a，更具体地包括p2a、e2a、f2a、t2a或其他来源的、具有自发断裂功能的肽，更优选地，所述自裂解序列的氨基酸序列如seq idno.11所示。

22、在本发明中，术语“嵌合抗原受体(car)”是一种包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域的基因工程结构。“嵌合抗原受体(car)”也称为“嵌合受体”、“嵌合免疫受体(cir)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽，例如任意类型的抗体或其片段。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。所述car中的铰链区、跨膜区可以与mil-15中的相同或不同。

23、优选地，所述融合蛋白中car包括第一、第二和/或第三代car。在一些方面中，第一代car是在抗原结合时仅提供cd3链诱导信号的car；在一些方面中，第二代car是提供此信号和共刺激信号的car，如包括来自共刺激受体(例如cd28或cd137)的胞内信号传导结构域的car；在一些方面中，第三代car是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的car。

24、最优选地，所述融合蛋白具有seq id no.19所示氨基酸序列。

25、具体地，在具体实施例中所述融合蛋白也称为car27。

26、另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体中含有特异性靶向her2的抗体，所述特异性靶向her2的抗体具有seq id no.3所示氨基酸序列。

27、优选地，所述嵌合抗原受体中还含有以下结构中的一种或多种：

28、1)cd8α铰链区和跨膜区，具有seq id no.5所示氨基酸序列；

29、2)4-1bb共刺激信号域，具有seq id no.7所示氨基酸序列；

30、3)cd3ζ信号域，具有seq id no.9所示氨基酸序列。

31、另一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码前述膜结合型il-15或融合蛋白或嵌合抗原受体的核酸序列，或者，所述核酸分子编码前述膜结合型il-15或融合蛋白或嵌合抗原受体。

32、在本发明中，“核酸分子”或“核酸”可交换使用，其是指任何长度的核苷酸链，并且包括dna或rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过dna或rna聚合酶掺入链的任何底物。

33、优选地，前述膜结合型il-15的编码序列与seq id no.14-16-18相连接所构成的序列有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％及以上同源性，可以根据使用环境的不同按照不同物种的偏好性进行密码子优化。

34、优选地，前述膜结合型il-15的编码序列是seq id no.14-16-18相连接所构成。

35、另一方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含前述核酸分子，或，所述载体表达前述膜结合型il-15或融合蛋白或嵌合抗原受体。

36、优选地，所述载体包括细菌质粒载体、噬菌体载体、酵母质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。

37、优选地，所述载体是腺病毒载体。

38、在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。

39、本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。

40、另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中表达前述膜结合型il-15或融合蛋白或嵌合抗原受体，或者，含有前述核酸分子或前述载体。

41、优选地，所述宿主细胞包括人的免疫细胞。

42、优选地，所述免疫细胞例如cd4+t细胞和/或cd8+t细胞、nk细胞(natural killercells)，nkt细胞(invariant natural killer t cells)，γδt细胞(gamma delta tcells)或巨噬细胞(macrophages)。

43、优选地，所述免疫细胞是nk细胞。

44、优选地，所述宿主细胞可以是分离自人体组织、细胞群，或由体外培养获得，例如由干细胞诱导分化得到的，或者所述宿主细胞也可以是成熟的商品化细胞系产品。

45、另一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中前述膜结合型il-15、融合蛋白、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、宿主细胞中的至少一种。

46、在本发明中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。

47、优选地，所述药物组合物进一步包括：药学上可接受的辅料。

48、在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”或者“药学上可接受的载体”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。

49、优选地，所述药物组合物可以为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂、气雾剂、膜剂、注射剂、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂或栓剂。

50、优选地，所述药物组合物制备为注射剂进行施用，所述注射包括任意部位的注射，例如皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。

51、另一方面，本发明提供了前述膜结合型il-15或融合蛋白或嵌合抗原受体在制备细胞中的应用。

52、具体地，所述细胞上表达car和/或mil15。

53、优选地，所述细胞是免疫细胞。

54、优选地，所述细胞包括人的免疫细胞。

55、优选地，所述免疫细胞包括cd4+t细胞、cd8+t细胞、nk细胞、inkt细胞、γδt细胞、巨噬细胞。

56、优选地，所述免疫细胞是nk细胞。

57、当所述细胞上表达car时即可称为car细胞，当细胞为nk细胞时即为car-nk细胞。在一种具体地实施例中所述car细胞制备过程中导入的car结构之后还连接了本发明所述膜结合型il-15，此时获得的细胞依然称为car细胞。

58、优选地，所述膜结合型il-15与car结构连接之后可以提升car细胞的治疗功效，具体包括促进car细胞增殖、减少细胞毒性。

59、最优选地，所述car细胞是car-nk细胞。

60、优选地，所述细胞用于过继细胞疗法中。

61、另一方面，本发明提供了一种高疗效细胞的制备方法，所述制备方法包括将前述膜结合型il-15或融合蛋白或嵌合抗原受体导入细胞的步骤。

62、更具体地，所述方法包括诱导所述融合蛋白表达的步骤。

63、用于引入基因工程改造的组分(例如，抗原受体，例如，car或tcr)的各种方法是熟知的，并可用于本文提供的方法和组合物。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的方法，包括经由病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒，非病毒载体或转座子，例如睡美人(sleeping beauty)转座子系统。基因转移的方法可以包括转导，电穿孔或导致基因转移到细胞中的其他方法。

64、另一方面，本发明提供了一种提升car细胞疗效的方法，所述方法包括在car结构之后连接前述膜结合型il-15的步骤。

65、更具体地，所述方法包括将前述融合蛋白导入细胞的步骤。

66、另一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括对受试者施用表达融合蛋白或嵌合抗原受体的细胞的方法，所述疾病是可以通过car细胞疗法治疗的疾病。

67、所述细胞疗法也可以称为过继细胞疗法。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。

68、本发明所述疾病包括癌症、自身免疫性疾病、代谢性疾病。

69、本发明所述癌症可以是血液癌症或具有实体瘤的癌症。优选地，所述癌症包括宫颈癌、精原细胞瘤、睾丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直肠癌、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、甲状腺癌、膀胱移行上皮癌、白血病、脑瘤、胃癌、腹膜癌、头颈癌、子宫内膜癌、肾癌、雌性生殖道癌、原位癌、神经纤维瘤、骨癌、皮肤癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤；

70、本发明所述自身免疫性疾病示例性的包括贲门失弛缓症；阿狄森氏病；成人斯蒂尔氏病；无丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变性；强直性脊柱炎；抗gbm/抗tbm肾炎；抗磷脂综合征；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性自主神经异常；自身免疫性脑脊髓炎；自身免疫性肝炎；自身免疫性内耳病(aied)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病变；自身免疫性荨麻疹。

71、本发明所述代谢性疾病示例性的包括糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖高渗综合征、低血糖症、痛风、蛋白质-能量营养不良症、维生素a缺乏病、坏血病、维生素d缺乏病、骨质疏松症。本领域技术人员所熟知的所述代谢性疾病即因代谢问题引起的疾病，包括代谢障碍和代谢旺盛等原因。

72、优选地，所述疾病是her2阳性的癌症。

73、本文中所用的术语“治疗”(及其语法变化形式例如“治疗的”和“治疗性”)指完全或部分减轻或减少疾病或病症或紊乱或与其相关的症状、不利作用或后果或表型。所需的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓疾病进展速度、改善或减轻疾病状态和减轻或改善预后。该术语不表示完全治愈疾病或完全消除任一症状或作用或所有症状或后果。

74、术语“疗效”是指可以通过多种手段表现的生物作用，包括但不限于，例如，肿瘤体积的减少，癌细胞数目的减少，转移灶数目的减少，期望寿命的增加，癌细胞增殖的减少，癌细胞存活的减少或与癌性病症相关的各种生理症状的改善。

75、本发明所述car细胞是指含有car的细胞，更具体地是指表达car的细胞，所述car-nk细胞是指含有或表达car的nk细胞。

76、本发明所述抗原结合结构域的靶标(抗原)可以是任意疾病的治疗靶点，例如cd16a、cd33、cd20、cd19、cd22、cd123、pdl-1、tigit、pd-1、tim3、ctla4、mica、micb、il-6、il-8、tnfα、cd26、cd36、ulbp2、cd30、cd200、igf-1r、muc4ac、muc5ac、trop-2、cmet、egfr、her1、her2、her3、psma、cea、b7h3、epcam、bcma、p-钙粘着蛋白、ceacam5、ul16结合蛋白、hla-dr、dll4、tyro3、axl、mer、cd122、cd155、pdgf-dd、tgf-β受体ii(tgf-βrii)的配体、tgf-βriii的配体、dnam1的配体、nkp46的配体、nkp44的配体、nkg2d的配体、nkp30的配体、scmhci的配体、scmhcii的配体、sctcr的配体、pdgf-dd的受体、干细胞因子(scf)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(flt3l)的受体、mica的受体、micb的受体、ulp16结合蛋白的受体、cd155的受体和cd122的受体。