姜黄素联合三氧化二砷对KG1a细胞自噬影响的研究方法

本发明涉及生物医药，具体涉及姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法。

背景技术：

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)是造血干/祖细胞在分化过程的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障碍和恶性增殖的造血系统恶性肿瘤；发病时骨髓中异常原始细胞及幼稚细胞大量增殖并抑制正常造血，并发生肝、脾、淋巴结等各脏器的浸润。目前临床治疗aml的药物除常规的化疗外，还有免疫疗法，靶向疗法等。虽然治疗取得一定进展，但是仍存在缓解率低，毒副作用大、复发率高、多药耐药等情况。

2、姜黄素是从姜科姜黄植物姜黄、郁金等根茎中提取出来的一种具有多种药理活性的植物多酚，现已被证实预防和治疗肿瘤效果确切，且具有毒性低、不良反应少，价格低廉等特质，许多研究者将其作为一种潜在的第3代抗肿瘤药物；三氧化二砷(ato)最早是从中药砷剂(砒霜)中提取而出，已被美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗apl，近年来发现其在aml临床治疗方面表现出了显著的疗效；我们以往研究已证实姜黄素联合三氧化二砷能有效抑制kg1a细胞增殖及诱导其凋亡；近年来有研究表明细胞自噬在aml的发展与治疗中具有关键作用，调控自噬功能有望提高aml治疗的疗效；而对于姜黄素联合三氧化二砷是否能够对白血病kg1a细胞具有杀伤作用，目前并没有相关的数据和实验能够证明，导致利用姜黄素联合三氧化二砷制备用于治疗急性髓系白血病的药物的研究一致处于停滞状态；

3、针对以上问题，亟需设计一种姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，来进一步从细胞自噬角度探究姜黄素联合三氧化二砷对白血病细胞的杀伤作用，以解决上述现有技术存在的问题，为其临床应用提供科学依据。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，本方法通过对比例证明姜黄素联合三氧化二砷可协同抑制白血病细胞kg1a增殖，诱导其发生自噬，且表现出时间依赖性，为利用姜黄素和三氧化二砷制备抑制和治疗白血病的药物奠定了理论基础。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，包括步骤

4、s201.细胞培养

5、将人aml kg1a细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的rpmi 1640培养基中，在37℃、5％co2的细胞培养箱中进行培养；

6、s202.对步骤s201培养的kg1a细胞进行分组及给药；

7、s203.观察细胞形态学变化

8、将处于对数生长期且状态良好的kg1a细胞均匀接种于6孔板中，按照上述分组给药48h后，观察并拍照记录各组细胞形态学变化；

9、s204.检测细胞增殖抑制率；

10、s205.对细胞进行染色，并在染色后观察kg1a细胞株自噬。

11、优选的，步骤s202所述的对kg1a细胞进行分组及给药的过程包括取对数生长期的kg1a细胞，分为a对照组、b姜黄素单药组、c三氧化二砷单药组、d姜黄素三氧化二砷联合给药组、e 3-ma抑制剂组、f3-ma抑制剂加姜黄素三氧化二砷联合给药组，根据预实验固定姜黄素给药溶度为40μmol/l，三氧化二砷给药溶度为3μmol/l，3-ma抑制剂给药溶度5mmol/l。

12、优选的，步骤s204所述的检测细胞增殖抑制率的方法为cck-8法，具体过程包括取对数生长期的kg1a细胞，胰蛋白酶消化后将细胞悬液密度调整为2×105/ml，接种于96孔板，每孔100μl；分别培养24h、48h和72h后，每孔加入10μl cck-8溶液继续置于培养箱培养4h，使用酶标仪检测450nm波长下各孔吸光度值，计算各组细胞增殖抑制率；

13、细胞增殖抑制率(％)＝(对照组od450平均值－实验组od450平均值)/(对照组od450平均值－空白组od450平均值)×100％。

14、优选的，步骤s205所述的对细胞进行染色，并在染色后观察kg1a细胞株自噬的过程包括将处于对数生长期状态良好的kg1a细胞，按1×105个/ml接种到6孔板中培养6h，离心弃上清，按分组给予药物处理细胞48h；向每孔中加入1ml mdc染色工作液，温育30min后置于荧光显微镜下观察。

15、优选的，所述研究方法还包括步骤

16、s3.统计学处理与分析

17、实验数据通过spss26.0软件进行统计分析，用graghpad prism 8.0绘制统计图；实验结果采用均值±标准差(x±s)表示，数据间比较采用单因素方差(one-wayanova)分析，且p＜0.05。

18、一种姜黄素联合三氧化二砷的应用，所述姜黄素联合三氧化二砷用于制备抑制和治疗白血病的药物。

19、本发明的有益效果是：本发明公开了姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：

20、本发明设计了一种姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，本方法通过取对数生长期的人白血病kg1a细胞，分为对照组(a组)、姜黄素单药组(b组)、三氧化二砷单药组(c组)、姜黄素三氧化二砷联合给药组(d组)、3-ma抑制剂组(e组)、3-ma抑制剂加姜黄素三氧化二砷联合给药组(f组)。姜黄素、三氧化二砷、3-ma抑制剂溶度分别为40μmol/l、3μmol/l、5mmol/l，给药培养48h。通过倒置显微镜下观察细胞形态学变化，cck-8法检测细胞增殖抑制率，单丹磺酰尸胺(mdc)染色法观察kg1a细胞株自噬情况。结果：b组、c组、d组，均表现细胞形态多呈不规则圆形，细胞碎片增加。cck-8法检测示，与a组比较，b组、c组、e组抑制率升高，且d组较b组、c组抑制率升高。mdc法检测显示，a为正常情况培养的kg1a细胞，荧光强度较弱。b组、c组、d组荧光强度明显增强，且f组荧光强度最明显；结论：姜黄素联合三氧化二砷可协同抑制白血病细胞kg1a增殖，诱导其发生自噬，且表现出时间依赖性，为利用姜黄素和三氧化二砷制备抑制和治疗白血病的药物奠定了理论基础。

技术特征：

1.姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，其特征在于：包括步骤

2.根据权利要求1所述的姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，其特征在于：步骤s202所述的对kg1a细胞进行分组及给药的过程包括取对数生长期的kg1a细胞，分为a对照组、b姜黄素单药组、c三氧化二砷单药组、d姜黄素三氧化二砷联合给药组、e3-ma抑制剂组、f3-ma抑制剂加姜黄素三氧化二砷联合给药组，根据预实验固定姜黄素给药溶度为40μmol/l，三氧化二砷给药溶度为3μmol/l，3-ma抑制剂给药溶度5mmol/l。

3.根据权利要求1所述的姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，其特征在于：步骤s204所述的检测细胞增殖抑制率的方法为cck-8法，具体过程包括取对数生长期的kg1a细胞，胰蛋白酶消化后将细胞悬液密度调整为2×105/ml，接种于96孔板，每孔100μl；分别培养24h、48h和72h后，每孔加入10μl cck-8溶液继续置于培养箱培养4h，使用酶标仪检测450nm波长下各孔吸光度值，计算各组细胞增殖抑制率；

4.根据权利要求1所述的姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，其特征在于：步骤s205所述的对细胞进行染色，并在染色后观察kg1a细胞株自噬的过程包括将处于对数生长期状态良好的kg1a细胞，按1×105个/ml接种到6孔板中培养6h，离心弃上清，按分组给予药物处理细胞48h；向每孔中加入1mlmdc染色工作液，温育30min后置于荧光显微镜下观察。

5.根据权利要求1所述的姜黄素联合三氧化二砷对kg1a细胞自噬影响的研究方法，其特征在于：所述研究方法还包括步骤

6.一种如权利要求1所述的姜黄素联合三氧化二砷的应用，其特征在于：所述姜黄素联合三氧化二砷用于制备抑制和治疗白血病的药物。

技术总结
本发明公开了姜黄素联合三氧化二砷对KG1a细胞自噬影响的研究方法，包括S201.细胞培养，将人AML KG1a细胞接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO<subgt;2</subgt;的细胞培养箱中进行培养；S202.对步骤S201培养的KG1a细胞进行分组及给药；S203.观察细胞形态学变化；S204.检测细胞增殖抑制率；S205.对细胞进行染色，并在染色后观察KG1a细胞株自噬；本方法通过对比例证明姜黄素联合三氧化二砷可协同抑制白血病细胞KG1a增殖，诱导其发生自噬，且表现出时间依赖性，为利用姜黄素和三氧化二砷制备抑制和治疗白血病的药物奠定了理论基础。

技术研发人员：曾英坚,伍振辉,余文超,陈抒鹏,章美玲,罗均允
受保护的技术使用者：江西中医药大学附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7