陆地棉GhGMP家族的组合型抗旱性相关分子标记及其应用

本发明涉及植物分子标记辅助育种领域，具体涉及陆地棉ghgmp家族的组合型抗旱性相关分子标记及其应用。

背景技术：

1、gdp-甘露糖焦磷酸化酶(gdp-mannose pyrophosphorylase,gmp)是植物抗坏血酸(asa)生物合成途径的第一个关键酶，抗坏血酸(asa)在植物和动物的氧化还原稳态中起着重要作用，主要是通过清除活性氧，且参与多种植物的生长并能抵御植物生物及非生物胁迫。在番茄、马铃薯中，增加gmp酶活性可提高asa含量，叶片的色素含量及净光合速率显著增加，延缓了植株衰老(christelle c,m gg,r fa,jan b,jens k,rolene b:manipulationof l-ascorbic acid biosynthesis pathways in solanum lycopersicum:elevatedgdp-mannose pyrophosphorylase activity enhances l-ascorbate levels in redfruit.planta 2012,235(3).林玲玲:gdp-d-甘露糖焦磷酸化酶基因(gmpase)在马铃薯中的功能分析.硕士.山东农业大学；2009.)。在水稻中，可调控水稻体内asa含量，参与水稻的盐胁迫和干旱胁迫应答，影响植株的根系生长(王亚云:gdp-甘露糖焦磷酸化酶基因osvtc1-1和osvtc1-3在水稻抗坏血酸合成与胁迫应答中的功能研究.硕士.中国农业科学院；2016.)；在拟南芥中，过表达水稻osvtc1-1基因能够恢复其asa的合成，增强拟南芥的抗旱性(ritesh k,ananda m,kumar sk,vishal s,subhasis s,kumar ss,ashwani p,latas-ps:functional screening of cdna library from a salt tolerant rice genotypepokkaliidentifies mannose-1-phosphate guanyl transferase gene(osmpg1)as a keymember of salinity stress response.plant molecular biology2012,79(6).)；在芹菜中，非生物胁迫下的aggmp基因表达量显著升高，调节芹菜asa积累还参与干旱胁迫响应(liu y h,wang h,liu j x,et al.aggmp encoding gdp-d-mannose pyrophosphorylasefrom celery enhanced the accumulation of ascorbic acid and resistance todrought stress in arabidopsis[j].peerj,2022,10:e12976.)。gmp基因在植物的生长发育过程中扮演着重要的角色，在非生物胁迫的逆境中起着重要作用。

2、棉花是世界上重要的经济作物，干旱缺水对棉花产量及纤维品质会造成极大的影响。功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来的一种新型分子标记。在传统育种下棉花育种年限长，花费人力物力过高也未能得到期望结果。而功能性分子标记带来了新的方向，功能性分子标记基于功能基因基序中功能性单核苷酸多态性(snp)位点开发而成，与基因共分离，一经开发可直接应用于基因的检测，在自然群体和人工群体中都适用，能及时对目标基因、目标性状进行检测。此外，由于功能标记来源于基因内部，直接反映目标性状表现，利用回交进行优良性状转育时，功能标记能更好的避免连锁累赘，减少供体不益基因向受体的导入，实现目标性状的优良组配。功能标记与分子标记辅助育种的结合，为推进育种速度、聚合优良功能基因、和改良目标性状提供了有效的手段和途径。选育和推广抗旱棉花品种是促进棉花生产持续稳定发展的有效途径之一，寻找与抗旱相关的基因，并开发特异性的分子标记，可为棉花抗旱分子标记辅助育种奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供以一种陆地棉ghgmp家族的组合型抗旱性相关分子标记及其应用。

2、第一方面，本发明要求保护棉花基因组中如下两个snp位点组合的单核苷酸多态性或用于检测棉花基因组中如下两个snp位点组合的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测棉花抗旱性中的应用；

3、所述两个snp位点组合分别记为ghgmp08-820snp和ghgmp30-874snp；

4、所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置为a07：8291850(正义链)，其核苷酸为c或t。对应于反义链，所述ghgmp08-820snp在棉花基因组中seq id no.4所示dna片段的第22位，为a或g。

5、所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置为d07：52577953(正义链)，其核苷酸为a或g。所述ghgmp30-874snp在棉花基因组中seq id no.8所示dna片段的第22位，为a或g。

6、参考基因组序列tm-1_zju_v2.1可从棉花cottongen数据库(https://www.cottongen.org/data/download/genome_tetraploid/ad1)获得。

7、进一步地，用于检测棉花基因组中所述两个snp位点组合的单核苷酸多态性的物质为后文第二方面中所述的成套kasp引物或后文第三方面中所述的试剂或试剂盒。

8、第二方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性的成套kasp引物。

9、本发明所要求保护的成套kasp引物由用于检测ghgmp08-820snp的kasp引物和用于检测ghgmp30-874snp的kasp引物组成；

10、所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置为a07：8291850，其核苷酸为c或t；

11、所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置为d07：52577953，其核苷酸为a或g。

12、其中，用于检测所述ghgmp08-820snp的kasp引物由引物a1、引物a2和引物a3组成；所述引物a1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列m和seq id no.1的第22-43位的单链dna；所述引物a2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列n和seq id no.2的第22-42位的单链dna；所述引物a3为核苷酸序列如序列表中seq id no.3所示的单链dna；

13、用于检测所述ghgmp30-874snp的kasp引物由引物b1、引物b2和引物b3组成；所述引物b1为自5’端到3’端依次为荧光标签序列m’和seq id no.5的第22-43位的单链dna；所述引物b2为自5’端到3’端依次为荧光标签序列n’和seq id no.6的第22-42位的单链dna；所述引物b3为核苷酸序列如序列表中seq id no.7所示的单链dna。

14、进一步地，所述荧光标签序列m为荧光标签序列vic，其核苷酸序列为seq id no.1的第1-21位；所述荧光标签序列n为荧光标签序列fam，其核苷酸序列为seq id no.2的第1-21位。

15、进一步地，所述荧光标签序列m’为荧光标签序列vic，其核苷酸序列为seq idno.5的第1-21位；所述荧光标签序列n’为荧光标签序列fam，其核苷酸序列为seq id no.6的第1-21位。

16、更进一步地，所述引物a1为核苷酸序列如seq id no.1所示的单链dna；所述引物a2为核苷酸序列如seq id no.2所示的单链dna。

17、更进一步地，所述引物b1为核苷酸序列如seq id no.5所示的单链dna；所述引物b2为核苷酸序列如seq id no.6所示的单链dna。

18、第三方面，本发明要求保护用于鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性的试剂或试剂盒。

19、本发明所要求保护的试剂或试剂盒中含有前文第二方面中所述的成套kasp引物。

20、第四方面，本发明要求保护前文第二方面所述的成套kasp引物或前文第三方面所述的试剂或试剂盒在如下任一中的应用：

21、(a1)鉴定或辅助鉴定棉花抗旱性；

22、(a2)鉴定或辅助鉴定棉花在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态；

23、(a3)比较待测棉花的抗旱性强弱；

24、(a4)比较待测棉花在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态；

25、(a5)选育抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种；

26、(a6)选育在干旱胁迫下产量相对较高的棉花单株或株系或品系或品种；

27、(a7)选育在干旱胁迫下有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)相对较多和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较重和/或单铃重(single bollweight，sbw)相对较重和/或铃数(bollnumber，bn)相对较多的棉花单株或株系或品系或品种；

28、(a8)选育在干旱胁迫下有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)相对较多和/或果枝数(fruit branch number，fbn)相对较多的棉花单株或株系或品系或品种；

29、(a9)筛选剔除抗旱性相对较弱的棉花单株；

30、(a10)筛选剔除在干旱胁迫下产量相对较低的棉花单株；

31、(a11)筛选剔除在干旱胁迫下有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)相对较少和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较轻和/或单铃重(single bollweight，sbw)相对较轻和/或铃数(bollnumber，bn)相对较少的棉花单株；

32、(a12)筛选剔除在干旱胁迫下有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)相对较少和/或果枝数(fruit branch number，fbn)相对较少的棉花单株。

33、第五方面，本发明要求保护如下任一方法：

34、方法i：一种比较待测棉花的抗旱性强弱的方法，包括如下步骤：检测待测棉花的基因组中如下两个snp位点组合的单核苷酸多态性，确定所述待测棉花的单倍型，根据所述待测棉花的单倍型按照如下确定所述待测棉花的抗旱性：hap4(tt/gg)单倍型的所述待测棉花的抗旱性强于或候选强于hap1(ct/gg)单倍型和hap3(ct/aa)单倍型的所述待测棉花的抗旱性。

35、该方法也可以用于比较待测棉花在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态。hap4(tt/gg)单倍型的所述待测棉花的在干旱胁迫下产量高于或候选高于hap1(ct/gg)单倍型和hap3(ct/aa)单倍型的所述待测棉花；具体而言，相比于hap1(ct/gg)单倍型和hap3(ct/aa)单倍型的所述待测棉花，hap4(tt/gg)单倍型的所述待测棉花的在干旱胁迫下有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)相对较多和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较重和/或单铃重(single boll weight，sbw)相对较重和/或铃数(bollnumber，bn)相对较多。hap4(tt/gg)单倍型的所述待测棉花的在干旱胁迫下有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)和/或果枝数(fruit branch number，fbn)高于或候选高于hap1(ct/gg)单倍型和hap3(ct/aa)单倍型的所述待测棉花。

36、方法ii：一种选育抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：检测待测棉花的基因组中如下两个snp位点组合的单核苷酸多态性，确定所述待测棉花的单倍型，选择基因组中所述两个snp位点组合为hap4(tt/gg)单倍型的所述待测棉花作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中所述两个snp位点组合为所述hap4(tt/gg)单倍型的棉花，最终获得抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种。

37、该方法也可用于选育在干旱胁迫下产量相对较高和/或有效铃数(efficiencybollnumber，ebn)相对较多和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较重和/或单铃重(single boll weight，sbw)相对较重和/或铃数(bollnumber，bn)相对较多和/或有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)相对较多和/或果枝数(fruitbranch number，fbn)相对较多的棉花单株或株系或品系或品种。最终获得的所述抗旱性相对较强的棉花单株或株系或品系或品种即为在干旱胁迫下产量相对较高和/或有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)相对较多和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较重和/或单铃重(single boll weight，sbw)相对较重和/或铃数(bollnumber，bn)相对较多和/或有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)相对较多和/或果枝数(fruit branch number，fbn)相对较多的棉花单株或株系或品系或品种。

38、方法iii：一种筛选剔除抗旱性相对较弱的棉花单株的方法，包括如下步骤：检测待测棉花单株的基因组中如下两个snp位点组合的单核苷酸多态性，确定所述待测棉花的单倍型，剔除基因组中所述两个snp位点组合为hap1(ct/gg)单倍型和/或hap3(ct/aa)的所述待测棉花单株。

39、该方法也可用于筛选剔除在干旱胁迫下产量相对较低和/或有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)相对较少和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较轻和/或单铃重(single boll weight，sbw)相对较轻和/或铃数(bollnumber，bn)相对较少和/或有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)相对较少和/或果枝数(fruit branch number，fbn)相对较少的棉花单株。最终剔除的所述抗旱性相对较弱的棉花单株即为在干旱胁迫下产量相对较低和/或有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)相对较少和/或单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)相对较轻和/或单铃重(single boll weight，sbw)相对较轻和/或铃数(bollnumber，bn)相对较少和/或有效果枝数(efficiency fruit branch number，efbn)相对较少和/或果枝数(fruit branchnumber，fbn)相对较少的棉花单株。

40、在上述各方法中，所述两个snp位点组合分别记为ghgmp08-820snp和ghgmp30-874snp。

41、所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置为a07：8291850，其核苷酸为c或t。

42、所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置为d07：52577953，其核苷酸为a或g。

43、所述hap4(tt/gg)单倍型是指所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置a07：8291850处的核苷酸为t的纯合型，并且所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置d07：52577953处的核苷酸为g的纯合型。

44、所述hap1(ct/gg)单倍型是指所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置a07：8291850处的核苷酸为c和t的杂合型，并且所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置d07：52577953处的核苷酸为g的纯合型。

45、所述hap3(ct/aa)单倍型是指所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置a07：8291850处的核苷酸为c和t的杂合型，并且所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置d07：52577953处的核苷酸为a的纯合型。

46、进一步地，所述“检测待测棉花的基因组中如下两个snp位点组合的单核苷酸多态性”可按照包括如下步骤的方法进行：以所述待测棉花的基因组dna为模板，利用前文第二方面所述的成套kasp引物或前文第三方面所述的试剂或试剂盒，分别针对所述ghgmp08-820snp和所述ghgmp30-874snp进行pcr扩增，将扩增所得两组产物分别进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测棉花的基因组中所述两个snp位点组合的单核苷酸多态性：

47、针对所述ghgmp08-820snp，若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列m对应的信号，则所述待测棉花的所述ghgmp08-820snp处的核苷酸为t的纯合型；若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列n对应的信号，则所述待测棉花的所述ghgmp08-820snp处的核苷酸为c的纯合型；若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列m对应的信号和所述荧光标签序列n对应的信号(即双重信号)，则所述待测棉花的所述ghgmp08-820snp处的核苷酸为c和t的杂合型；

48、针对所述ghgmp30-874snp，若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列m’对应的信号，则所述待测棉花的所述ghgmp30-874snp处的核苷酸为g的纯合型；若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列n’对应的信号，则所述待测棉花的所述ghgmp30-874snp处的核苷酸为a的纯合型；若所述待测棉花的扩增产物的荧光信号为所述荧光标签序列m’对应的信号和所述荧光标签序列n’对应的信号(即双重信号)，则所述待测棉花的所述ghgmp08-820snp处的核苷酸为a和g的杂合型。

49、第六方面，本发明要求保护前文第二方面所述的成套kasp引物或前文第三方面所述的试剂或试剂盒或前文第五方面所述的方法在棉花育种中的应用。

50、在上述各方面中，所述棉花为陆地棉。如单倍型为所述hap1(ct/gg)单倍型、所述hap3(ct/aa)单倍型或所述hap4(tt/gg)单倍型的陆地棉。

51、在本发明的具体实施方式中，所述棉花具体为表4中所示的186份棉花材料。在这186份棉花材料中，除了所述hap1(ct/gg)单倍型、所述hap3(ct/aa)单倍型和所述hap4(tt/gg)单倍型外，还存在hap2(ct/ga)单倍型和hap5(tt/aa)单倍型，这两个单倍型的棉花材料抗旱性偏向于中间型。所述hap2(ct/ga)单倍型是指所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置a07：8291850处的核苷酸为c和t的杂合型，并且所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置d07：52577953处的核苷酸为g和a的杂合型。所述hap5(tt/aa)单倍型是指所述ghgmp08-820snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置a07：8291850处的核苷酸为t的纯合型，并且所述ghgmp30-874snp在棉花参考基因组tm-1_zju_v2.1中的物理位置d07：52577953处的核苷酸为a的纯合型。

52、在上述各方面中，所述抗旱性主要体现在干旱胁迫下产量性状和/或表观形态。进一步地，所述产量性状通过如下指标体现：有效铃数(efficiency bollnumber，ebn)、单铃籽棉重(single boll seeds weight，sbsw)、单铃重(single boll weight，sbw)、铃数(bollnumber，bn)；所述表观形态通过如下指标体现：有效果枝数(efficiency fruitbranch number，efbn)、果枝数(fruit branch number，fbn)。

53、实验证明，本发明开发了一种能够对棉花育种材料抗旱性相关性状指标密切关联的组合型抗旱相关分子标记，应用于棉花抗旱性优良材料的快速鉴别和选育，为快速鉴定及筛选大规模棉花抗旱性群体奠定基础，为后续棉花分子育种做出贡献。