一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其应用

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其应用。

背景技术：

1、o-乙酰-l-高丝氨酸(oah)是一种酰基化氨基酸，是合成多种重要物质的平台化合物，可作为l-高丝氨酸、l-蛋氨酸和s-腺苷甲硫氨酸等物质的重要前体。此外，o-乙酰-l-高丝氨酸还是一种人体内必需氨基酸的甲硫氨酸的前体，而甲硫氨酸不仅可以用作饲料和食品的添加剂，并且能够用作输液溶液和药物的原料。因此o-乙酰-l-高丝氨酸是一种很有应用前景的平台化学品，具有很高的市场需求和经济价值。

2、在微生物细胞内，o-乙酰-l-高丝氨酸的生物合成是通过高丝氨酸乙酰转移酶(metx)催化关键前体l-高丝氨酸和乙酰辅酶a之间的酰化反应而实现的。目前报道的文献中，主要是通过代谢工程手段和基因编辑技术提高l-高丝氨酸和乙酰辅酶a等前体物质的积累来获得oah，但是oah的产量不高，这主要是由于metx的催化活性相对较低，且会受到产物oah的反馈抑制，从而会对oah的生物合成产生限制。因此，构建酶活性提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体对于o-乙酰-l-高丝氨酸的高效生物合成具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其应用，用于o-乙酰-l-高丝氨酸的高效生物合成。

2、本发明解决上述问题的技术方案如下：

3、一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体，相对于seq id no.2所示氨基酸序列而言，仅存在第58位由甘氨酸突变为丙氨酸、第93位由天冬酰胺突变为苯丙氨酸、第136位由缬氨酸突变为异亮氨酸、第159位由苏氨酸突变为缬氨酸、185位由赖氨酸突变为精氨酸、第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸、第210位由甘氨酸突变为丝氨酸、第265位由缬氨酸突变为丙氨酸、第355位由缬氨酸突变为异亮氨酸中的一个突变或多个组合突变。

4、作为优选，seq id no.2：

5、mptlapsgqleiqaigdvsteagaiitnaeiayhrwgeyrvdkegrsnvvliehaltgdsnaadwwadllgpgkaintdiycvictnviggcngstgpgsmhpdgnfwgnrfpatsirdqvnaekqfldalgittvaavlggsmggartlewaamypetvgaaavlavsarasawqigiqsaqikaiendhhwhegnyyesgcnpatglgaarriahltyrgeleiderfgtkaqknenplgpyrkpdqrfavesyldyqadklvqrfdagsyvlltdalnrhdigrdrgglnkalesikvpvlvagvdtdilypyhqqehlsrnlgnllamakivspvghdafltesrqmdrivrnffslispdednpstyiefyi

6、作为优选，仅存在第210位由甘氨酸突变为丝氨酸和第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第210位由甘氨酸突变为丝氨酸、第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸和第185位由赖氨酸突变为精氨酸的组合突变；仅存在第210位由甘氨酸突变为丝氨酸、第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸和第265位由缬氨酸突变为丙氨酸的组合突变；仅存在第210位由甘氨酸突变为丝氨酸、第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸和第58位由甘氨酸突变为丙氨酸的组合突变；仅存在第210位由甘氨酸突变为丝氨酸、第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸和第159位由苏氨酸突变为缬氨酸的组合突变；仅存在第185位由赖氨酸突变为精氨酸和第210位由甘氨酸突变为丝氨酸的组合突变；仅存在第185位由赖氨酸突变为精氨酸、第210位由甘氨酸突变为丝氨酸和第355位由缬氨酸突变为异亮氨酸的组合突变；仅存在第185位由赖氨酸突变为精氨酸、第210位由甘氨酸突变为丝氨酸和第136位由缬氨酸突变为异亮氨酸的组合突变；仅存在第185位由赖氨酸突变为精氨酸、第210位由甘氨酸突变为丝氨酸和第93位由天冬酰胺突变为苯丙氨酸的组合突变；仅存在第265位由缬氨酸突变为丙氨酸和第355位由缬氨酸突变为异亮氨酸的组合突变。

7、本发明提供了所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因。

8、作为优选，所述编码基因的核苷酸序列是在seq id no.1所示核苷酸酸序列的基础上进行突变获得的。

9、作为优选，seq id no.1：

10、atgcccaccctcgcgccttcaggtcaacttgaaatccaagcgatcggtgatgtctccaccgaagccggagcaatcattacaaacgctgaaatcgcctatcaccgctggggtgaataccgcgtagataaagaaggacgcagcaatgtcgttctcatcgaacacgccctcactggagattccaacgcagccgattggtgggctgacttgctcggtcccggcaaagccatcaacactgatatttactgcgtgatctgtaccaacgtcatcggtggttgcaacggttccaccggacctggctccatgcatccagatggaaatttctggggtaatcgcttccccgccacgtccattcgtgatcaggtaaacgccgaaaaacaattcctcgacgcactcggcatcaccacggtcgccgcagtacttggtggttccatgggtggtgcccgcaccctagagtgggccgcaatgtacccagaaactgttggcgcagctgctgttcttgcagtttctgcacgcgccagcgcctggcaaatcggcattcaatccgcccaaattaaggcgattgaaaacgaccaccactggcacgaaggcaactactacgaatccggctgcaacccagccaccggactcggcgccgcccgacgcatcgcccacctcacctaccgtggcgaactagaaatcgacgaacgcttcggcaccaaagcccaaaagaacgaaaacccactcggtccctaccgcaagcccgaccagcgcttcgccgtggaatcctacttggactaccaagcagacaagctagtacagcgtttcgacgccggctcctacgtcttgctcaccgacgccctcaaccgccacgacattggtcgcgaccgcggaggcctcaacaaggcactcgaatccatcaaagttccagtccttgtcgcaggcgtagataccgatattttgtacccctaccaccagcaagaacacctctccagaaacctgggaaatctactggcaatggcaaaaatcgtatcccctgtcggccacgatgctttcctcaccgaaagccgccaaatggatcgcatcgtgaggaacttcttcagcctcatctccccagacgaagacaacccttcgacctacatcgagttctacatctaa

11、作为优选，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4、seq idno.5或seq id no.6所示。

12、作为优选，seq id no.3：

13、atgcccaccctcgcgccttcaggtcaacttgaaatccaagcgatcggtgatgtctccaccgaagccggagcaatcattacaaacgctgaaatcgcctatcaccgctggggtgaataccgcgtagataaagaaggacgcagcaatgtcgttctcatcgaacacgccctcactggagattccaacgcagccgattggtgggctgacttgctcggtcccggcaaagccatcaacactgatatttactgcgtgatctgtaccaacgtcatcggtggttgcttcggttccaccggacctggctccatgcatccagatggaaatttctggggtaatcgcttccccgccacgtccattcgtgatcaggtaaacgccgaaaaacaattcctcgacgcactcggcatcaccacggtcgccgcagtacttggtggttccatgggtggtgcccgcaccctagagtgggccgcaatgtacccagaaactgttggcgcagctgctgttcttgcagtttctgcacgcgccagcgcctggcaaatcggcattcaatccgcccaaattcgcgcgattgaaaacgaccaccactggcacgaaggcaactactacgaatccggctgcaacccagccaccggactctccgccgcccgacgcatcgcccacctcacctaccgtggcgaactagaaatcgacgaacgcttcggcaccaaagcccaaaagaacgaaaacccactcggtccctaccgcaagcccgaccagcgcttcgccgtggaatcctacttggactaccaagcagacaagctagtacagcgtttcgacgccggctcctacgtcttgctcaccgacgccctcaaccgccacgacattggtcgcgaccgcggaggcctcaacaaggcactcgaatccatcaaagttccagtccttgtcgcaggcgtagataccgatattttgtacccctaccaccagcaagaacacctctccagaaacctgggaaatctactggcaatggcaaaaatcgtatcccctgtcggccacgatgctttcctcaccgaaagccgccaaatggatcgcatcgtgaggaacttcttcagcctcatctccccagacgaagacaacccttcgacctacatcgagttctacatctaa

14、作为优选，seq id no.4：

15、atgcccaccctcgcgccttcaggtcaacttgaaatccaagcgatcggtgatgtctccaccgaagccggagcaatcattacaaacgctgaaatcgcctatcaccgctggggtgaataccgcgtagataaagaaggacgcagcaatgtcgttctcatcgaacacgccctcactggagattccaacgcagccgattggtgggctgacttgctcggtcccggcaaagccatcaacactgatatttactgcgtgatctgtaccaacgtcatcggtggttgcaacggttccaccggacctggctccatgcatccagatggaaatttctggggtaatcgcttccccgccacgtccattcgtgatcaggtaaacgccgaaaaacaattcctcgacgcactcggcatcaccacggtcgccgcagtacttggtggttccatgggtggtgcccgcaccctagagtgggccgcaatgtacccagaaactgttggcgcagctgctgttcttgcagtttctgcacgcgccagcgcctggcaaatcggcattcaatccgcccaaattcgcgcgattgaaaacgaccaccactggcacgaaggcaactactacgaatccggctgcaccccagccaccggactctccgccgcccgacgcatcgcccacctcacctaccgtggcgaactagaaatcgacgaacgcttcggcaccaaagcccaaaagaacgaaaacccactcggtccctaccgcaagcccgaccagcgcttcgccgtggaatcctacttggactaccaagcagacaagctagtacagcgtttcgacgccggctcctacgtcttgctcaccgacgccctcaaccgccacgacattggtcgcgaccgcggaggcctcaacaaggcactcgaatccatcaaagttccagtccttgtcgcaggcgtagataccgatattttgtacccctaccaccagcaagaacacctctccagaaacctgggaaatctactggcaatggcaaaaatcgtatcccctgtcggccacgatgctttcctcaccgaaagccgccaaatggatcgcatcgtgaggaacttcttcagcctcatctccccagacgaagacaacccttcgacctacatcgagttctacatctaa

16、作为优选，seq id no.5：

17、atgcccaccctcgcgccttcaggtcaacttgaaatccaagcgatcggtgatgtctccaccgaagccggagcaatcattacaaacgctgaaatcgcctatcaccgctggggtgaataccgcgtagataaagaaggacgcagcaatgtcgttctcatcgaacacgccctcactggagattccaacgcagccgattggtgggctgacttgctcggtcccggcaaagccatcaacactgatatttactgcgtgatctgtaccaacgtcatcggtggttgcaacggttccaccggacctggctccatgcatccagatggaaatttctggggtaatcgcttccccgccacgtccattcgtgatcaggtaaacgccgaaaaacaattcctcgacgcactcggcatcaccacggtcgccgcagtacttggtggttccatgggtggtgcccgcaccctagagtgggccgcaatgtacccagaaactgttggcgcagctgctgttcttgcagtttctgcacgcgccagcgcctggcaaatcggcattcaatccgcccaaattcgcgcgattgaaaacgaccaccactggcacgaaggcaactactacgaatccggctgcaacccagccaccggactctccgccgcccgacgcatcgcccacctcacctaccgtggcgaactagaaatcgacgaacgcttcggcaccaaagcccaaaagaacgaaaacccactcggtccctaccgcaagcccgaccagcgcttcgccgtggaatcctacttggactaccaagcagacaagctagtacagcgtttcgacgccggctcctacgtcttgctcaccgacgccctcaaccgccacgacattggtcgcgaccgcggaggcctcaacaaggcactcgaatccatcaaagttccagtccttgtcgcaggcgtagataccgatattttgtacccctaccaccagcaagaacacctctccagaaacctgggaaatctactggcaatggcaaaaatcgtatcccctgtcggccacgatgctttcctcaccgaaagccgccaaatggatcgcatcattaggaacttcttcagcctcatctccccagacgaagacaacccttcgacctacatcgagttctacatctaa

18、作为优选，seq id no.6：

19、atgcccaccctcgcgccttcaggtcaacttgaaatccaagcgatcggtgatgtctccaccgaagccggagcaatcattacaaacgctgaaatcgcctatcaccgctggggtgaataccgcgtagataaagaaggacgcagcaatgtcgttctcatcgaacacgccctcactggagattccaacgcagccgattggtgggctgacttgctcggtcccggcaaagccatcaacactgatatttactgcgtgatctgtaccaacgtcatcggtggttgcaacggttccaccggacctggctccatgcatccagatggaaatttctggggtaatcgcttccccgccacgtccattcgtgatcaggtaaacgccgaaaaacaattcctcgacgcactcggcatcaccacggtcgccgcagtacttggtggttccatgggtggtgcccgcaccctagagtgggccgcaatgtacccagaaactgttggcgcagctgctgttcttgcagtttctgcacgcgccagcgcctggcaaatcggcattcaatccgcccaaattcgcgcgattgaaaacgaccaccactggcacgaaggcaactactacgaatccggctgcaccccagccaccggactctccgccgcccgacgcatcgcccacctcacctaccgtggcgaactagaaatcgacgaacgcttcggcaccaaagcccaaaagaacgaaaacccactcggtccctaccgcaagcccgaccagcgcttcgccgtggaatcctacttggactaccaagcagacaagctagtacagcgtttcgacgccggctcctacgtcttgctcaccgacgccctcaaccgccacgacattggtcgcgaccgcggaggcctcaacaaggcactcgaatccatcaaagttccagtccttgtcgcaggcgtagataccgatattttgtacccctaccaccagcaagaacacctctccagaaacctgggaaatctactggcaatggcaaaaatcgtatcccctgtcggccacgatgctttcctcaccgaaagccgccaaatggatcgcatcgtgaggaacttcttcagcctcatctccccagacgaagacaacccttcgacctacatcgagttctacatctaa

20、本发明提供了包含所述编码基因的表达载体。

21、作为优选，所述表达载体为pet28a(+)。

22、本发明提供了包含所述表达载体的基因工程菌。

23、作为优选，所述基因工程菌为大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。

24、本发明还提供了所述的基因工程菌在制备o-乙酰高丝氨酸中的应用。

25、作为优选，以培养所述基因工程菌得到的高丝氨酸乙酰转移酶突变体作为催化剂，以l-高丝氨酸和乙酰辅酶a为底物，制备o-乙酰-l-高丝氨酸。

26、本发明的技术思路如下所示：将来源于c.glutamicum atcc 13032的高丝氨酸乙酰转移酶基因构建到所选表达载体上，以获得带有所述高丝氨酸乙酰转移酶编码基因的重组质粒。将上述重组质粒转入所选表达载体大肠杆菌感受态中，进行目的酶的诱导表达并对酶活性进行测定。采用pcr突变方法对所述的高丝氨酸乙酰转移酶基因进行定向进化。通过对目的基因片段进行定向pcr扩增获得目的基因突变序列文库，并将其构建在表达载体上，进而获得高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库。

27、通过酶活测定对本发明所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库进行筛选，获得了突变位点为g58a、n93f、v136i、t159v、g210s、n204t、v355i、k185r(即第58位由甘氨酸突变为丙氨酸，第93位由天冬酰胺突变为苯丙氨酸，第136位由缬氨酸突变为异亮氨酸，第159位由苏氨酸突变为缬氨酸，第210位由甘氨酸突变为丝氨酸，第204位由天冬酰胺突变为苏氨酸，第355位由缬氨酸突变为异亮氨酸，第185位由赖氨酸突变为精氨酸)的酶活提高的突变体。

28、本发明还对所述的高丝氨酸乙酰转移酶进行同源建模，并对其进行分子对接，对得到的氨基酸残基进行丙氨酸扫描，经过筛选获得了酶活性改变较大的三个位点v265、t57、q249，并对其进行饱和突变，再次筛选获得了酶活性提高的v265a(即原始基因序列第265位由缬氨酸突变为丙氨酸)。

29、最后将所获得的酶活性提高的突变体g58a、n93f、v136i、t159v、g210s、n204t、v265a、v355i、k185r进行组合突变，获得了最优的突变组合k185r-g210s-n204t，该突变体具有最高的酶活。

30、本发明具有以下有益效果：

31、本发明分别利用pcr突变和基于结构信息的定点饱和突变方法获得了多种酶活性提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，最优的突变组合体即k185r-g210s-n204t，其酶活性是野生型酶活的1.44倍，菌株发酵72h后o-乙酰-l-高丝氨酸产量高达12.44g/l；因此，本发明的高丝氨酸乙酰转移酶突变体对于o-乙酰-l-高丝氨酸的高效生物合成具有重要意义。