一种鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒不同流行毒株的引物及试剂盒

本发明属于基因检测，具体涉及一种鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒不同流行毒株的引物及试剂盒。

背景技术：

1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是一种高度接触性传染病，各种猪只均易感染，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)感染引起，临床表现为发热、母猪屡配不孕或中后期流产、仔猪成活率降低、不同阶段猪只呼吸障碍等症状[1]。prrs在世界各地广泛流行，严重影响母猪繁殖性能和育肥猪料肉比，给世界各国的生猪养殖业造成巨大的经济损失[2]。

2、prrsv为动脉炎病毒科(arteriviridae)动脉炎病毒属(arterivirus)成员，是单股正链rna病毒，基因组长13～15kb，至少包含有10个开放阅读框，prrsv分为prrsv-1型和prrsv-2型两个基因型，目前国内流行的主要为prrsv-2型[3]。prrsv具有广泛的遗传变异性，流行以来经常发生突变，流行毒株包括经典prrsv(c-prrsv)、高致病性蓝耳毒株(hp-prrsv)[4]、类nadc30毒株(类nadc30)和类nadc34毒株(类nadc34)[5]。类nadc30毒株和类nadc34毒株均因其较高的重组和突变率近年来备受关注[6]。

3、随着生猪养殖规模的扩大及养殖密度的增加，猪病原混合感染比例逐渐上升，prrsv亦为严重的免疫抑制疾病，该病毒变异频繁，且存在多毒株共存情况，导致病情错综复杂，临床症状相似难辨，给该病的快速诊断带来严峻挑战，因此实验室诊断的准确性和及时性显得至关重要。prrs病原实验室诊断的方法较多，目前已有文献[7-12]报道分别鉴别c-prrsv、hp-prrsv、类nadc30的rt-pcr或rt-qpcr检测方法，但尚未有鉴别c-prrsv、hp-prrsv、类nadc30、类nadc34毒株rt-pcr检测方法的报道。

4、参考文献

5、[1]陈胜男,林金森,邵洋洋,等.2021年广东省北美型prrsv流行病学调查及其orf5基因遗传进化分析[j].中国动物传染病学报,2022,30(05):171-175.

6、chen sheng-nan,lin jin-sen,shao yang-yang,et al.detection ofnorthamerican type porcine reproductive and respiratory syndrome virus and geneticanalysis ofits orf5 gene in guangdong in 2021[j].chinese journalofanimalinfectiousdiseases,2022,30(5):171-175.(in chinese)

7、[2]zhang a,young j r,suon s,et al.investigating the financial impactof porcine reproductive and respiratory syndrome on smallholder pig farmersin cambodia[j].tropical animal health and production,2017,49(4):791-806.

8、[3]trevisan g,sharma a,gauger p,et al.prrsv2 genetic diversitydefined by rflp patterns in the united states from 2007to 2019[j].journal ofveterinarydiagnosticinvestigation,2021,33(5):920-931.

9、[4]童光志,周艳君,郝晓芳等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析[j].中国预防兽医学报,2007(05):323-327.

10、tong guang-zhi,zhou yan-jun,hao xiao-fang,et al.identification andmolecular epidemiology ofthe very virulent porcine reproductive andrespiratory syndromeviruses emerged in china[j].chinese journal ofpreventiveveterinary medicine,2007(05):323-327.(in chinese)

11、[5]xu h,song s,zhao j,et al.apotential endemic strain in china:类nadc34 porcine reproductive and respiratory syndrome virus[j].transboundaryandemergingdiseases,2020,67:1730-1738.

12、[6]risser j,ackerman m,evelsizer r,et al.porcine reproductive andrespiratory syndrome virus genetic variability a management and diagnosticdilemma[j].virologyjournal,2021,18(1):206.

13、[7]周茜,于孔森,林青青,等.检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类nadc30毒株的双重荧光定量pcr方法[j],中国兽医科学,2023,53(04):462-467.

14、zhou qian,yu kong-sen,lin qing-qing,et al.discrimination prrsvandnadc30 strain with a duplex

15、taqman real-time pcr[j].chinese veterinary science,2023,53(04):462-467.(in chinese)

16、[8]chen n,ye m,xiao y,et al.development of universal and quadruplexreal-time rt-pcr assays for simultaneous detection and differentiation ofporcine reproductive and respiratory syndrome viruses[j].transboundaryandemergingdiseases,2019,66(6):2271-2278.

17、[9]long f,chen y,shi k,et al.development ofa multiplex crystaldigital rt-pcr for differential detection of classical,highly pathogenic,and类nadc30 porcine reproductive and respiratory syndrome virus[j].animals,2023,13(4):594.

18、[10]林华,郭万柱,韩国全,等.对prrsv快速分型的多重rt-pcr方法的建立与应用[j].中国兽医学报,2011,31(01):6-10.

19、lin hua,guo wan-zhu,han guo-quan,et al.development and applicationofmultiplex rt-pcr assay technigues for differentsubtype ofporcinereproductive and respiratory syndrome virus[j].chinese journal of veterinaryscience,2011,31(01):6-10.(in chinese)

20、[11]徐雷,赵军,杨晓宇,等.猪繁殖与呼吸综合征类nadc30与hp-prrsv毒株rt-pcr鉴别方法的建立与应用[j].江苏农业学报,2019,35(01):109-113.

21、xu lei,zhao jun,yang xiao-yu,et al.establishment and application ofrt-pcr methods for identifying porcine reproductive and respiratory syndromevirus(prrsv)nadc30-ike strain and hp-prrsv strain[j].jiangsujournal ofagriculturalsciences,2019,35(01):109-113.(in chinese)

22、[12]li y,ji g,xu x,et al.development and application of an r t-pcr todifferentiate the prevalent na-prrsv strains in china[j].the open virologyjournal,2017,11:66-72.doi:10.2174/1874357901711010066.

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒不同流行毒株的引物，能够有效鉴别出prrsv经典毒株(c-prrsv)、高致病毒株(hp-prrsv)、类nadc30毒株(类nadc30)及类nadc34毒株(类nadc34)，具有良好的检测特异性和较高的检测灵敏度。

2、本发明提供了一种鉴别prrsv经典毒株、高致病毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的引物，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物。

3、本发明提供了所述引物在制备鉴别prrsv经典毒株、高致病毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株中的试剂盒中的应用。

4、优选的，所述鉴别prrsv经典毒株、高致病毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的pcr反应体系为20μl，包括以下组分：2×pcr mastermix10μl、10μmol/ml上下游引物各1.6μl、cdna2μl和ddh2o 4.8μl。

5、优选的，所述鉴别prrsv经典毒株、高致病毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的pcr反应程序为95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min 15s，40个循环；72℃延伸5min。

6、优选的，所述引物扩增prrsv经典毒株的目标片段长度为1072bp；

7、所述引物扩增高致病毒株的目标片段长度为982bp；

8、所述引物扩增类nadc30毒株的目标片段长度为679bp；

9、所述引物扩增类nadc34毒株的目标片段长度为772bp。

10、优选的，所述引物扩增prrsv经典毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:5所示；

11、所述引物扩增高致病毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:6所示；

12、所述引物扩增类nadc30毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:7所示；

13、所述引物扩增类nadc34毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:8所示。

14、本发明提供了一种鉴别prrsv经典毒株、高致病毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的试剂盒，包括所述引物和pcr检测试剂。

15、优选的，所述pcr检测试剂包括2×pcr mastermix。

16、优选的，还包括反转录试剂和阳性标准品。

17、优选的，所述阳性标准品包括以下至少一种：含所述引物扩增prrsv经典毒株的目标片段的重组质粒、包含有所述引物扩增高致病毒株的目标片段的重组质粒、包含所述引物扩增类nadc30毒株的目标片段的重组质粒、包含所述引物扩增类nadc34毒株的目标片段的重组质粒；

18、所述引物扩增prrsv经典毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:5所示；

19、所述引物扩增高致病毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:6所示；

20、所述引物扩增类nadc30毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:7所示；

21、所述引物扩增类nadc34毒株的目标片段的核苷酸序列如seq id no:8所示。

22、本发明提供了一种鉴别prrsv经典毒株、高致病毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的引物，包括核苷酸序列如seq id no:1所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:2所示的反向引物。本发明通过对比四类毒株在nsp2基因核苷酸序列缺失差异，设计1对简并引物，即可高特异性和高灵敏度的鉴别四类毒株，省去测序时间，极大地提高基层兽医实验室的检测效率，并进行了临床样品检测的应用评价，以期为prrsv不同毒株的快速鉴别诊断和prrs的防控提供技术支撑。