抗破伤风的纳米抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用

本发明属于免疫治疗生物医药，具体涉及抗破伤风的纳米抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用。

背景技术：

1、破伤风是一种由破伤风梭菌分泌的神经毒素(tetanus toxin,tent)引起的急性致命疾病，以全身骨骼肌僵硬和抽搐痉挛为特征。任何人都可能感染破伤风，但这种疾病在未接种含破伤风类毒素的疫苗的新生儿和孕妇中尤为常见和严重。妊娠期间或妊娠结束后6周内的破伤风称为“孕产妇破伤风”，生命的前28天内的破伤风称为“新生儿破伤风”。虽然破伤风类毒素疫苗能有效预防破伤风，但在中低收入国家，破伤风仍是地方病，而且破伤风疫苗并非终身免疫，需要每隔10年加强免疫。但在许多国家，人们对加强免疫的意识非常薄弱，即使在今天，破伤风每年仍造成数十万人瘫痪死亡。

2、破伤风毒素作用迅速，毒性很强。当患者被确诊为感染破伤风杆菌后，体内一般已存在大量细菌和毒素，使用抗菌素已不能挽救患者生命。破伤风的治疗主要分为主动接种甲醛灭活破伤风类毒素疫苗和被动注射人破伤风免疫球蛋白(tetanus immunoglobulin,tig)或含有多克隆抗体的抗毒素。然而，人破伤风免疫球蛋白和破伤风抗毒素都有很大的局限性，因为人破伤风免疫球蛋白价格昂贵，而且不能完全消灭破伤风梭菌，而破伤风抗毒素则容易引起过敏反应。因此，无需免疫过程而在体外产生的特异性tent抗体将是替代破伤风免疫球蛋白或抗毒素的更好选择。

3、目前可用的破伤风中和抗体是相对分子质量较大的常规抗体，其稳定性、亲和力、特异性和组织穿透能力都有待提高。纳米抗体(nanobody,nb)是一种天然存在于骆驼科动物体内的重链抗体，其抗原结合片段具有独立的结构域。纳米抗体的分子质量仅为12-15kd，是目前已知的具有完整抗原结合功能的最小抗体，具有相对分子质量小、组织穿透力强、稳定性高、特异性强等优点。因此，迫切需要应用纳米抗体技术，开发高效安全的中和破伤风毒素的纳米抗体。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要问题是开发一种能够有效中和破伤风毒素的纳米抗体，并能在制备针对破伤风的诊断或治疗的药物中发挥作用。本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向tent-hc的纳米抗体或含有所述纳米抗体的抗原结合片段。

3、第一方面，本发明提供了抗破伤风毒素的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3，所述纳米抗体为t83-13；

4、所述t83-13的cdr1的氨基酸序列为seq id no.6，所述t83-13的cdr2的氨基酸序列为seq id no.7，所述t83-13的cdr3的氨基酸序列为seq id no.8。

5、上述纳米抗体或其抗原结合片段中除了包含所述互补决定区外，还包含4个框架区fr1、fr2、fr3和fr4；

6、所述t83-13的fr1的氨基酸序列为seq id no.2，所述t83-13的fr2的氨基酸序列为seq id no.3，所述t83-13的fr3的氨基酸序列为seq id no.4，所述t83-13的fr4的氨基酸序列为seq id no.5。

7、上述纳米抗体或其抗原结合片段中所述t83-13的氨基酸序列是seq id no.1。

8、上述术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。

9、第二方面，本发明提供了抗破伤风毒素的重链抗体，所述重链抗体含有前述的纳米抗体。

10、上述重链抗体中包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.1或者与seq id no.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。

11、上述重链抗体为t83-13-fc，所述t83-13-fc的氨基酸序列为seq id no.11。

12、第三方面，本发明提供了生物材料，所述生物材料为如下任一种：

13、d1)含有上述纳米抗体或上述重链抗体的单克隆抗体；

14、d2)含有上述的纳米抗体的小分子抗体。

15、所述小分子抗体可为如下任一种：

16、f1、fab抗体；

17、f2、fv抗体；

18、f3、单链抗体；

19、f4、fab′片段。

20、术语“fab′片段”含有一条抗体轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条抗体重链的部分，由此可在两个fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab′)2分子。

21、术语“f(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab′片段组成。

22、术语“纳米抗体(单域抗体)”(vhh)为由抗体重链可变区组成的多肽。单域抗体可按照如下方法制备：将抗体重链可变区(vh)通过基因工程方法表达，获得仅含vh片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。

23、术语“最小识别单位(mru)”是指仅含可变区中单一cdr结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。

24、术语“fab抗体”是由抗体的重链fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。可按照如下方法制备fab抗体：将重链fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达fab抗体(fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链fd指fab中约1/2的h链部分(约含225个氨基酸残基，包括vh、ch1和部分铰链区)。

25、术语“fv抗体”是仅由抗体的重链可变区和轻链可变区组成的化合物。重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接。可按照如下方法制备fv抗体：可分别构建含有vh和vl基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性fv抗体；也可在载体中的vh和vl之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成fv抗体(fv片段)。

26、术语“单链抗体”(scfv)是用短肽将抗体的重链可变区和轻链可变区连接而成的多肽。可按照如下方法制备scfv：是指用寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(scfv)。多肽链能自发折叠成天然构象，保持fv的特异性和亲和力。

27、第四方面，本发明提供了遗传材料，所述遗传材料为下述任一种：

28、g1)核酸分子，所述核酸分子编码前述纳米抗体或其抗原结合片段、或前述的重链抗体；

29、g2)含有g1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

30、第五方面，本发明要求保护抗破伤风的药物，所述药物包含前述纳米抗体或其抗原结合片段或前述所述的重链抗体。

31、所述药物还包括生理上或药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

32、本文中，上述“生理上或药学上可接受的载体或稀释剂”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害药物组合物中所述试剂的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。

33、本文中，“生理上或药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于所述试剂的服用的惰性物质。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。

34、第六方面，本发明要求保护下述任一所示应用：

35、m1)前述遗传材料在制备前述纳米抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体中的应用；

36、m2)前述纳米抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体在制备前述药物中的应用；

37、m3)前述纳米抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体或前述遗传材料或前述药物在制备用于预防和/或治疗破伤风梭菌所致疾病的产品中的应用；

38、m4)前述纳米抗体或其抗原结合片段或权前述重链抗体或前述遗传材料在制备用于检测破伤风梭菌的产品中的应用；

39、m5)前述纳米抗体或其抗原结合片段或前述重链抗体或前述遗传材料或前述药物在制备用于中和破伤风梭菌分泌的神经毒素的产品中的应用；

40、m6)前述纳米抗体或其抗原结合片段或前述所述的重链抗体或前述遗传材料或药物在制备用于检测破伤风梭菌分泌的神经毒素的产品中的应用。

41、本发明提供的抗破伤风毒素的纳米抗体，能够较好的中和破伤风毒素。实验证明，纳米抗体t83-13与thc蛋白特异性良好，只结合thc抗原。5μg的t83-13可以完全中和20×ld50 tent的致死剂量，其对于tent攻击保护时间可达到2～3天。高剂量的tent中毒(20×ld50)12小时内使用t83-13抗体处理可有效避免小鼠死亡。