磁性捕获探针及制备方法、试剂盒及应用

本申请是关于生物探针，特别是关于一种磁性捕获探针及制备方法、试剂盒及应用。

背景技术：

1、鲍曼不动杆菌是临床最常见的革兰式阴性菌，广泛存在于医院环境中，是引起患者的下呼吸道、血流、伤口等部位感染的主要病原菌之一。在icu中感染鲍曼不动杆菌导致的死亡率可以达到45％-60％。患者体液中可能存在鲍曼不动杆菌数量少，鲍曼不动杆菌特异性生物标志物浓度低的情况，因此，开发患者体液样本中鲍曼不动杆菌高效捕获富集的方法对检测鲍曼不动杆菌变得极为重要。

2、磁珠已成功用于各种病原菌的快速捕获。目前市场用于细菌捕获的磁珠以抗体修饰的磁珠为主，具有特异性高的特点，然而抗体修饰的方法较复杂、成本高，不利于普及性使用。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种磁性捕获探针及制备方法、试剂盒及应用，以解决现有技术中存在的细菌捕获的磁珠以抗体修饰的磁珠为主，然而抗体修饰的方法较复杂、成本高，不利于普及性使用的技术问题，并提供一种快速富集鲍曼不动杆菌的磁性捕获探针。

2、为实现上述目的，本申请采用的一个技术方案是：

3、提供一种磁性捕获探针的制备方法，包括：

4、将氨基磁珠与戊二醛混合，孵育得到醛基磁珠；

5、将所述醛基磁珠与引物混合，孵育得到引物修饰磁珠，所述引物的5’端修饰有氨基；

6、将所述引物修饰磁珠与模板混合，依次高温变性、低温退火，以使所述引物修饰磁珠识别所述模板并通过碱基互补配对形成带有缺口的环状模板修饰磁珠，之后加入t4 dna连接酶孵育连接所述缺口，得到环状模板修饰磁珠，其中，所述模板包括依次排列的靶向序列和特异性序列，且所述模板的5’端修饰有磷酸基团，所述靶向序列用于靶向鲍曼不动杆菌，所述特异性序列与所述引物的序列至少部分互补；

7、对所述环状模板修饰磁珠进行滚环扩增，得到多聚核酸适配体修饰磁珠，即磁性捕获探针；

8、其中，所述引物的序列如seq id no.1所示，所述模板的序列如seq id no.2所示。

9、在一个或多个实施方式中，所述将氨基磁珠与戊二醛混合，孵育得到醛基磁珠的步骤中，所述氨基磁珠和所述戊二醛的质量比为1：(5-50)，孵育的温度为10～30℃，时间为0.8～6h。

10、在一个或多个实施方式中所述将所述醛基磁珠与引物混合，孵育得到引物修饰磁珠的步骤包括：

11、将所述醛基磁珠和引物混合孵育，得到第一中间产物；

12、向所述第一中间产物中加入bsa溶液，继续孵育以封闭磁珠表面非特异性结合位点，得到第二中间产物；

13、对所述第二中间产物进行磁性分离去除所述bsa溶液，之后加入去离子水重悬，得到引物修饰磁珠。

14、在一个或多个实施方式中所述将所述醛基磁珠和引物混合孵育，得到第一中间产物的步骤中，所述醛基磁珠的质量和所述引物的物质的量之比为(0.2～1)mg：1×10-4μmol，所述孵育为在10～30℃下孵育0.8～6h，或所述孵育为在3～5℃下孵育10～14h；

15、所述向所述第一中间产物中加入bsa溶液，继续孵育以封闭磁珠表面非特异性结合位点，得到第二中间产物的步骤中，所述孵育的温度为10～30℃，孵育时间为1～3h。

16、在一个或多个实施方式中所述将所述引物修饰磁珠与模板混合，依次高温变性、低温退火的步骤中，所述引物修饰磁珠的体积和所述模板的物质的量之比为(0.2～1)mg：1×10-4μmol；

17、所述依次高温变性、低温退火具体为：加热至95℃保温反应2min，之后降温至65℃保温反应2min，之后以0.5℃/30s的降温速率冷却至20℃保温反应2min，之后降温至10℃保温反应10min。

18、在一个或多个实施方式中，所述加入t4 dna连接酶孵育连接所述缺口，得到环状模板修饰磁珠的步骤中，所述t4 dna连接酶体积和所述带有缺口的环状模板修饰磁珠的质量比为5μl：(0.8～1.2)mg，所述孵育具体为在3～5℃下孵育10～14h，之后在70～80℃下孵育8～12min。

19、在一个或多个实施方式中，所述对所述环状模板修饰磁珠进行滚环扩增的步骤具体为：

20、将所述环状模板修饰磁珠在phi29 dna聚合酶催化下以dntps为底物进行滚环扩增，得到多聚核酸适配体修饰磁珠，所述环状模板修饰磁珠质量和所述phi29 dna聚合酶的体积比为(0.2～1)mg：2μl，滚环扩增的反应温度为30～37℃下孵育6～10h，之后在70～80℃下孵育8～12min。

21、为实现上述目的，本申请采用的另一个技术方案是：

22、提供一种上述任一实施方式所述的方法制备得到的磁性捕获探针。

23、为实现上述目的，本申请采用的又一个技术方案是：

24、提供一种试剂盒，包括：

25、氨基磁珠；

26、引物，序列如seq id no.1所示，且所述引物的5’端修饰有氨基；

27、模板，序列如seq id no.2所示，所述模板包括依次排列的靶向序列和特异性序列，且所述模板的5’端修饰有磷酸基团，所述靶向序列用于靶向鲍曼不动杆菌，所述特异性序列与所述引物的序列至少部分互补；

28、t4 dna连接酶；

29、phi29 dna聚合酶；

30、dntps。

31、为实现上述目的，本申请采用的另一个技术方案是：

32、提供一种上述任一实施方式所述的试剂盒在富集鲍曼不动杆菌中的应用。

33、区别于现有技术，本申请的有益效果是：

34、本申请利用多聚核酸适配体对鲍曼不动杆菌的特异性识别，与纳米材料磁珠的磁分离技术相结合，形成基于多聚核酸适配体的磁性dna捕获探针，能够有效实现鲍曼不动杆菌的捕获和分离富集，捕获率达到93.41％，有效解决患者体液样本中鲍曼不动杆菌丰度低的问题，为接下来的检测打下良好的基础；

35、本申请的磁性捕获探针可通过简单的磁分离即可实现鲍曼不动杆菌的捕获和富集，相对于现有流式分离等技术依赖昂贵的大型仪器设备及试剂，有效降低了成本，并具有高生物相容性；

36、本申请的磁性捕获探针利用dna滚环扩增技术制备多聚适配体，并进一步与纳米材料磁珠相结合，形成磁性dna捕获探针，避免了探针的复杂设计和合成，简化了制备方法。

技术特征：

1.一种磁性捕获探针的制备方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将氨基磁珠与戊二醛混合，孵育得到醛基磁珠的步骤中，所述氨基磁珠和所述戊二醛的质量比为1：(5～50)，孵育的温度为10～30oc，时间为0.8～6h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述醛基磁珠与引物混合，孵育得到引物修饰磁珠的步骤包括：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将所述醛基磁珠和引物混合孵育，得到第一中间产物的步骤中，所述醛基磁珠的质量和所述引物的物质的量之比为(0.2～1)mg：1×10-4μmol，所述孵育为在10～30oc下孵育0.8～6h，或所述孵育为在3～5oc下孵育10～14h；

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述引物修饰磁珠与模板混合，依次高温变性、低温退火的步骤中，所述引物修饰磁珠的质量和所述模板的物质的量之比为(0.2～1)mg：1×10-4μmol；

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述加入t4 dna连接酶孵育连接所述缺口，得到环状模板修饰磁珠的步骤中，所述t4 dna连接酶的体积和所述带有缺口的环状模板修饰磁珠的质量比为5μl：(0.8～1.2)mg，所述孵育具体为在3～5oc下孵育10～14h，之后在70～80oc下孵育8～12min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述对所述环状模板修饰磁珠进行滚环扩增的步骤具体为：

8.一种采用权利要求1至7任一所述的方法制备得到的磁性捕获探针。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括：

10.一种权利要求9所述的试剂盒在富集鲍曼不动杆菌中的应用。

技术总结
本申请公开了一种磁性捕获探针及制备方法、试剂盒及应用，制备方法包括将氨基磁珠与戊二醛混合，孵育得到醛基磁珠；将醛基磁珠与引物混合，孵育得到引物修饰磁珠；将引物修饰磁珠与模板混合，依次高温变性、低温退火，加入T4DNA连接酶孵育连接缺口得到环状模板修饰磁珠；对环状模板修饰磁珠进行滚环扩增，得到多聚核酸适配体修饰磁珠，即磁性捕获探针。本申请利用多聚核酸适配体对鲍曼不动杆菌的特异性识别，与磁珠的磁分离技术相结合，形成基于多聚核酸适配体的磁性DNA捕获探针，能够有效实现鲍曼不动杆菌的捕获和分离富集。

技术研发人员：赵怀鑫,缪青,刘英,仰大勇,李帅
受保护的技术使用者：天津大学浙江研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17