藏北嵩草内参基因及其引物和应用

本发明属于分子生物学，具体涉及藏北嵩草内参基因及其引物应用，具体地说，是利用藏北嵩草在不同处理、不同组织的最适内参基因的筛选及其引物和应用。

背景技术：

1、藏北嵩草(kobresia littledalei)为莎草科(cyperaceae)嵩草属(kobresia)的重要成员，也是该属中第一个建立参考基因组的物种。藏北嵩草多生长在湖泊和河流边缘的低洼地带，在盐碱沼泽地带也有分布，对极端环境(如寒冷、辐射、干旱和强风)有很高的耐受性，因此为应对青藏高原的诸多不利因素，进化出多种应对策略。藏北嵩草适应性强，生物量大，适口性好，营养丰富，是青藏高原高山草甸的优势种，对维持草原的生态平衡至关重要。

2、实时荧光定量pcr(rt-qpcr)的出现极大地改变了基因表达水平波动的检测和测量方法。它具有动态范围广、灵敏度高、特异性强、通量大和精确度高的优点。然而，rna质量、完整性、反转录效率和扩增效率等诸多因素均会影响rt-qpcr结果的精确性。因此，实验中通常引入参考基因来减少或纠正目标基因定量方法中的错误，以确保结果准确并消除分析误差。理想的内参基因应该在所有实验条件下都能稳定表达，包括生物体的不同组织和发育阶段；然而，这种一直稳定的参考基因几乎不存在。因为涉及维持细胞基本活动和编码蛋白质的基因编码的产物是细胞生物活动所必需的，并且可能在任何条件下产生，因此经常被选为参考基因。例如18s核糖体rna(18s)基因是所有细胞中最保守的基因之一；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因是糖酵解、葡萄糖生成和光合作用等碳固定途径中的关键酶。然而研究表明，在不同物种、不同刺激以及不同阶段下内参基因的表达情况会发生改变，且不同组织的最适内参基因并不完全相同。因此，针对每个物种独特的样本类型和实验条件选择最合适的参考基因至关重要。迄今为止，还没有关于鉴定嵩草属植物中最稳定参考基因的报道。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于，提供藏北嵩草不同处理、不同组织的最适内参基因。本发明的第二个目的在于，提供所述最适内参基因的引物。本发明的第三个目的在于，提供所述最适内参基因及其引物在基因表达中的应用。

2、为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

3、一种藏北嵩草内参基因，其特征在于，所述藏北嵩草经甘露醇、氯化钠、赤霉素、脱落酸处理后不同组织的内参基因为actin基因和gapdh基因，所述actin基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述gapdh基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

4、所述actin基因的引物为：

5、正向核苷酸序列为5’-tgctagactcgggagatggtgttag-3’；

6、反向核苷酸序列为5’-aagtcaagacgtaggattgcatggg-3’；

7、所述gapdh基因的引物为：

8、正向核苷酸序列为5’-ggaggagtctgagggcaaac-3’；

9、反向核苷酸序列为5’-tggcggactaggtcaacaac-3’。

10、根据申请人的研究表明，所述藏北嵩草gapdh基因作为内参基因在藏北嵩草不同处理或藏北嵩草各个组织中荧光定量中的应用。所述不同处理为甘露醇处理、氯化钠处理、赤霉素处理和脱落酸处理；所述各个组织为藏北嵩草的叶、茎、根。

11、所述藏北嵩草actin基因和gapdh基因共同作为内参基因在藏北嵩草不同处理或藏北嵩草各个组织中荧光定量中的应用。所述内参基因actin、gapdh用于荧光定量pcr分析。

12、本发明与现有技术相比，带来的技术创新在于：

13、对现有技术的贡献之一在于，选择了actin，tbp，28s rrna，18s rrna，ubq，gapdh，sod，rpl6，his，ef1-alpha，tua等13个常用的内参基因作为藏北嵩草不同组织的候选内参基因，通过genorm、normfinder、bestkeeper、delta ct和reffinder等5种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了适用于藏北嵩草在不同处理、不同组织的最适内参基因actin、gapdh。

14、对现有技术的贡献之二在于，根据内参基因并设计了候选内参基因的荧光定量pcr引物，该引物特异性强，扩增效率高，填补了藏北嵩草在不同处理、不同组织没有共同内参基因的现状。

15、对现有技术的贡献之三在于，首次为藏北嵩草在不同处理、不同组织的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础，同时可提高功能基因研究的重复性、稳定性和可靠性。

技术特征：

1.一种藏北嵩草内参基因，其特征在于，所述藏北嵩草内参基因为藏北嵩草actin基因或藏北嵩草gapdh基因，所述藏北嵩草actin基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述藏北嵩草gapdh基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

2.如权利要求1所述的藏北嵩草内参基因，其特征在于，所述actin基因的引物为：

3.权利要求1或2所述的藏北嵩草gapdh基因作为内参基因在藏北嵩草不同处理或藏北嵩草各个组织中荧光定量中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述不同处理为甘露醇处理、氯化钠处理、赤霉素处理和脱落酸处理；所述各个组织为藏北嵩草的叶、茎、根。

5.权利要求1或2所述的藏北嵩草actin基因和gapdh基因共同作为内参基因在藏北嵩草不同处理或藏北嵩草各个组织中荧光定量中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述内参基因actin、gapdh用于荧光定量pcr分析。

技术总结
本发明公开了藏北嵩草内参基因及其引物和应用，以藏北嵩草为材料，运用RT‑qPCR技术结合geNorm，NormFinder，BestKeeper和RefFinder内参基因稳定性分析软件对13个候选内参基因的表达稳定性进行分析。通过geNorm软件计算得出适合藏北嵩草不同处理和组织最适合内参基因数目为2个。综合4个软件的分析结果，筛选出不同处理和组织下中稳定性最好的2个内参基因为藏北嵩草ACTIN和GAPDH。本发明填补了藏北嵩草不同处理、不同组织中没有稳定内参基因的技术空白，可为进一步研究藏北嵩草关键功能基因提供参考和基因差异表达研究提供有效的校正工具；本发明提出的检测引物具有特异性，大大的提高了检测效率，提高了检测结果的可信度。

技术研发人员：孙浩洋,李硕,何学青,杨培志,呼天明
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/7