GPX4作为生物标志物在乙肝相关慢加急性肝衰竭预后中的应用

本发明属于疾病预后和分子生物学，具体涉及gpx4作为生物标志物在乙肝相关慢加急性肝衰竭预后中的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,aclf)是一种影响慢性肝病患者的复杂综合征，以强烈的全身炎症反应、器官衰竭和不良预后为特征。在亚洲，乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)感染是导致慢加急性肝衰竭的主要原因，占慢加急性肝衰竭的70％以上。乙肝相关慢加急性肝衰竭(hepatitis bvirus-associated acute-on-chronic liver failure,hbv-aclf)通常进展迅速，在4周之内出现多器官功能衰竭,死亡率高，预后差。由于及时的临床干预可以阻止hbv-aclf的进展，提高患者的生存率。因此，当前急需找到能够正确评估hbv-aclf患者的严重程度和有效预测其预后的生物标志物，建立有效且便捷的综合评估预后标准，制订有效的治疗方案，对挽救患者生命的急诊治疗至关重要。

3、研究表明，表观遗传学仅影响基因表达与表型表现，dna序列不发生任何变化，不改变遗传信息，其主要包括dna甲基化、组蛋白修饰及非编码rna的表达等。当前dna甲基化是表观遗传学领域的重要研究方向，在肝衰竭发展过程中发挥重要作用，已逐渐成为医学领域的研究热点。dna甲基化是指通过dna甲基转移酶(dnmts)催化作用，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)作为甲基的供体，将dna鸟嘌呤(g)旁的胞嘧啶(c)(cpg二核苷酸)通过甲基化作用修饰成为5’-甲基胞嘧啶的过程。基因启动子区的甲基化可抑制相应基因的转录，从而影响细胞或组织特异性基因的表达。有研究表明，感染hbv的宿主存在dnmts表达异常及cpg二核苷酸甲基化异常的现象。

4、目前研究表明aclf的病理生理机制主要包括剧烈的全身炎症反应、免疫功能障碍、线粒体功能障碍、代谢改变和氧化应激。由于慢性肝病基础及诱因不同,东西方aclf的发病机制存在明显差异。在亚太地区，aclf多由hbv再激活或重叠其他嗜肝病毒感染引起。然而hbv-aclf的发病机制极其复杂,目前认为是环境、hbv病毒及宿主等多因素相互作用的结果,但确切的机制尚未阐明。国内外普遍认为免疫细胞介导的炎症反应是hbv-aclf发病机制的核心环节，氧化应激也参与其中。由于hbv感染和细胞毒效应介导的免疫紊乱，氧化应激导致的细胞死亡、组织损伤，进而引起促炎性细胞因子失衡，进一步促进hbv-aclf的进展。gpx4作为一种谷胱甘肽过氧化物酶，是铁死亡调控通路中关键调节因子，通过清除自由基，参与水解脂质过氧化物，从而保护细胞免于脂质过氧化物积累，减轻氧化应激损伤，是一个抗氧化分子。研究表明gpx4参与多种生物学功能，包括神经元丧失、自噬、细胞修复、炎症、铁死亡、细胞凋亡和氧化应激。间接或直接抑制gpx4，均会导致清除脂质过氧化物能力不足，细胞内脂质过氧化物集聚，引起氧化应激损伤以及铁死亡。铁死亡后细胞释放damps通过tlr4通路、ager通路和sting1通路等引起炎症反应。因此，在hbv-aclf的发生发展过程中，gpx4作为一个抗氧化分子及铁死亡关键调控因子，参与其氧化损伤与炎症损伤。gpx4基因启动子区域的高甲基化，使gpx4表达降低，进而导致机体抗氧化能力降低，使得肝功能进一步受损，患者预后不良。甲基化荧光定量法(methylight)是目前应用最为广泛的dna甲基化检测方法，具有较强的特异性、敏感性和可操作性。

5、目前肝衰竭的预后预测方法常用meld评分、sofa评分等，仍有其局限性，许多肝衰竭新的预后标记物及评估体系正被研究。但由于肝衰竭的发病机制复杂，病情发展迅速，影响预后因素较多，肝衰竭的精准预测较为困难。因此，亟需一种可以评估肝衰竭预后的生物学标志物，实现对肝衰竭病情早期、灵敏和稳定的预测，以便及时、有效的治疗。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本技术提供gpx4作为生物标志物在乙肝相关慢加急性肝衰竭预后中的应用。具体的，通过研究首次发现gpx4基因启动子在预后不良的乙肝相关慢加急性肝衰竭患者中呈现高甲基化状态，提示gpx4基因启动子的甲基化程度与乙肝相关慢加急性肝衰竭患者的预后密切相关，因此对gpx4基因启动子的甲基化进行定量检测可以提示乙肝相关慢加急性肝衰竭的预后，从而辅助临床治疗。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面，提供检测谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)基因启动子甲基化程度的物质在制备慢加急性肝衰竭预后评估或辅助预后评估产品中的应用。

4、所述产品可以是检测试剂盒、检测装置和/或设备。

5、所述慢加急性肝衰竭为乙肝相关慢加急性肝衰竭。本发明经过广泛而深入的研究，通过对多例乙肝相关慢加急性肝衰竭(hbv-aclf)患者的外周血单个核细胞中gpx4基因启动子的甲基化状态进行分析，并与患者的疾病常用预后指标(meld评分)进行受试者特征工作曲线分析，发现gpx4基因启动子甲基化状态与乙肝相关慢加急性肝衰竭预后存在密切关系，gpx4基因启动子在乙肝相关慢加急性肝衰竭死亡者中呈高甲基化状态，对于乙肝相关慢加急性肝衰竭患者的外周血单个核细胞中gpx4启动子甲基化状态的分析有助于协助临床医生评估乙肝相关慢加急性肝衰竭患者的预后，以达到预测和指导治疗的作用。

6、本发明的第二个方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒用于慢加急性肝衰竭预后评估或辅助预后评估；所述检测试剂盒包含上述针对gpx4启动子的甲基化特异性引物对和taqman荧光探针。

7、其中，所述检测试剂盒还可以包括内参基因的特异性引物对和taqman荧光探针；所述内参基因可以为actb。

8、本发明的第三个方面，提供一种慢加急性肝衰竭预后评估或辅助预后评估的系统，所述系统至少包括：

9、分析模块，所述分析模块至少包含：用于确定受试者的待测样品中谷胱甘肽过氧化物酶4基因启动子甲基化程度的检测物质，以及；

10、评估模块，所述评估模块至少包含：根据分析模块中确定的所述谷胱甘肽过氧化物酶4基因启动子甲基化程度对所述受试者进行预后评估。

11、与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：

12、上述技术方案应用基于taqman荧光探针的实时定量甲基化特异性pcr检测方法(methylight)，相较于甲基化特异性聚合酶链反应msp-pcr定性检测方法，可消除非特异性扩增，更好的避免dna污染对结果的影响，确保检测结果的特异度。基于taqman荧光探针的实时定量甲基化特异性pcr是利用荧光标记的taqman荧光探针追踪pcr产物，实时反映甲基化特异性pcr过程，对甲基化特异性pcr产物进行分析，从而得到待测样本的初始模板量。该检测方法能够检测到人体外周血单个核细胞中极微量的dna，灵敏度高，特异性强，适用于检测dna含量少、损失率高的标本。

13、此外，上述技术方案的待测样品取自受试者(如乙肝相关慢加急性肝衰竭患者)外周血，取材便捷，操作简易且病人创伤小。

14、上述技术方案采用试剂盒组装，相较其他检测技术，具有取材简便、检测快速、结果精确等优点，可作为辅助临床医师对肝衰竭患者预后的预测依据，具有深远的临床意义，适于大规模推广应用。利用一个试剂盒就可以做到由采血到定量检测与乙肝相关慢加急性肝衰竭预后相关的gpx4基因甲基化程度的全过程，方便、快捷、适用，具有良好的实际应用之价值。