一种内溶素SW16及其工程改造和应用

本发明属于基因工程领域，涉及内溶素sw16及其工程改造和应用。更具体地，本发明涉及包含目的的内溶素蛋白，通过表达所述内溶素，对挖掘得到的天然内溶素进行酶活验证。此外，本发明还涉及一种使用经工程改造的天然内溶素对铜绿假单胞菌进行抑菌的方法。

背景技术：

1、目前，全球性的抗生素滥用和过度使用已导致越来越多的新型耐药菌的出现和扩散，对公共卫生构成重大威胁[1]。统计数据，每年由多重耐药细菌(multi-drug resistant，mdr)病原体引起的感染夺走全世界约70万患者的生命，预计这一数字在未来几年还会增加[2]。因此，在抗击感染的斗争中，开发创新抗菌药物势在必行[3]。根据美国nih(https://clinicaltrials.gov/)和who国际临床试验平台(ictrp)临床试验数据库(https://www.who.int/clinical-trials-registry-platform)统计，目前有80种抗菌药物正在进行临床试验阶段，其中包括46种抗菌药物和34种非抗菌药物，包括抗体、微生物组调节剂、免疫调节剂、噬菌体和噬菌体内溶素。噬菌体内溶素(phage endolysins，lysins)是一种肽聚糖(peptidoglycan，pg)降解酶，由噬菌体编码，在噬菌体周期结束时裂解宿主细菌细胞膜，已成为一类有前途的新型抗菌物。在这些非传统的治疗方案中，噬菌体内溶素具备以下关键优势[4]：(1)特异性和有效活性：它可以有针对性的对多重耐药细菌进行杀伤，同时不破坏正常人体微生态群落。(2)低耐药性风险：由于其依赖相对保守的肽聚糖结构，因此内溶素具有较低的产生耐药性可能性。(3)协同作用：当与其他内溶素或抗生素联合使用时，内溶素能够对定植于黏膜表面并形成生物膜的致病菌产生协同效应。它们对革兰氏阳性菌特别有效[5]。迄今为止，针对革兰阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌和艰难梭杆菌，已经有三个与噬菌体内溶素相关的药品进入临床试验阶段[6-8]：sal200、cf-301和lmn-201。与此相反，针对革兰氏阴性菌的溶解菌素的开发相对滞后。革兰氏阴性菌细胞壁的外膜(outermembrane，om)形成了溶酶进入和降解pg层的屏障，使得溶酶治疗对革兰氏阴性菌无效[9]。为了克服这一障碍，研究人员使用辅助内溶素渗透细胞外膜的可行方法，包括与化学试剂，称为外膜渗透剂(omp)共同给药，这种化学试剂可以破坏细胞外膜，如乙二胺四乙酸(edta)或柠檬酸，或通过蛋白质工程对内溶素进行修饰，包括通过将天然内溶素与穿膜肽进行融合，这可能是一种很有希望的对抗革兰氏阴性菌的策略[10]。

2、为了扩大潜在的临床应用候选内溶素，本领域仍然需要挖掘出更多更有效的内溶素。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种内溶素sw16。

2、本发明的另一目的在于提供一种工程改造内溶素kwk-sw16。

3、本发明的再一目的在于提供上述sw16或kwk-sw16的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种内溶素sw16，其氨基酸序列如seq id no：1所示，或者是如seq id no：1通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示，或者与seq id no：1所示氨基酸序列相似度95％以上且仍具有相同或相似功能的序列。

6、上述内溶素sw16相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

7、(1)编码所述内溶素sw16的核酸分子；

8、(2)含有(1)中所述核酸分子的表达盒；

9、(3)含有(1)中所述核酸分子的重组表达载体；

10、(4)含有(2)中所述表达盒的重组表达载体；

11、(5)含有(1)中所述核酸分子的重组微生物；

12、(6)含有(2)中所述表达盒的重组微生物；

13、(7)含有(3)或(4)所述重组表达载体的重组微生物。

14、进一步，(1)中所述的核酸分子为编码内溶素sw16的基因序列，如seq id no：3所示，或者是如seq id no：3通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。

15、进一步，(3)、(4)中所述重组表达载体的出发载体为pet系列的载体等；优选为pet32a(+)载体。

16、进一步，(5)、(6)、(7)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物、酵母或高等真核细胞；所述原核生物包括埃希氏菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、沙门氏菌属(salmonella)以及假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)的细菌。更具体而言，所述原核生物是埃希氏菌属，优选大肠杆菌(e.coli)，具体可为大肠杆菌bl21(de3)。

17、一种工程改造内溶素kwk-sw16，其氨基酸序列如seq id no：2所示，或者是如seqid no：2通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示，或者与seq id no：2所示氨基酸序列相似度95％以上且仍具有相同或相似功能的序列。

18、上述工程改造内溶素kwk-sw16相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

19、(a)编码所述工程改造内溶素kwk-sw16的核酸分子；

20、(b)含有(a)中所述核酸分子的表达盒；

21、(c)含有(a)中所述核酸分子的重组表达载体；

22、(d)含有(b)中所述表达盒的重组表达载体；

23、(e)含有(a)中所述核酸分子的重组微生物；

24、(f)含有(b)中所述表达盒的重组微生物；

25、(g)含有(c)或(d)所述重组表达载体的重组微生物。

26、进一步的，(a)中所述核酸分子为编码工程改造内溶素kwk-sw16的基因序列，如seq id no：4所示，或者是如seq id no：4通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。

27、进一步的，(c)、(d)中所述重组表达载体的出发载体为pet系列的载体等；优选为pet32a(+)载体。

28、进一步的，(e)、(f)、(g)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物、酵母或高等真核细胞；所述原核生物包括埃希氏菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、沙门氏菌属(salmonella)以及假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)的细菌。更具体而言，所述原核生物是埃希氏菌属，优选大肠杆菌(e.coli)，具体可为大肠杆菌bl21(de3)。

29、上述内溶素sw16相关的生物材料或工程改造内溶素kwk-sw16相关的生物材料在制备内溶素sw16或工程改造内溶素kwk-sw16中的应用。

30、一种内溶素sw16或工程改造内溶素kwk-sw16的制备方法，包括如下步骤：培养重组微生物，从重组微生物中得到内溶素sw16或工程改造内溶素kwk-sw16。

31、进一步的，一种工程改造内溶素kwk-sw16的制备方法，包括如下步骤：

32、使用基因工程的方法，在内溶素sw16的n端连接一个短肽，构成工程改造内溶素kwk-sw16，将基因序列转化至宿主微生物中，获得重组微生物，并培养重组微生物，从重组微生物中制备得到工程改造内溶素kwk-sw16。

33、上述内溶素sw16及其生物材料或工程改造内溶素kwk-sw16及其生物材料的应用，为下述应用中的任意一种或多种组合：

34、①在制备抗革兰氏阴性菌的产品中的应用；

35、②在制备治疗革兰氏阴性菌感染的产品中的应用；

36、③在制备抗革兰氏阳性菌的产品中的应用；

37、④在制备治疗革兰氏阳性菌感染的产品中的应用。

38、进一步的，①、②中所述的革兰氏阴性菌包括但不限于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和伤鼠伤寒沙门氏菌等中的至少一种；

39、进一步的，③、④中所述的革兰氏阳性菌包括但不限于单增李斯特菌等。

40、在其中一个实施例中，本发明的工程改造内溶素kwk-sw16能够使得铜绿假单胞菌裂解，其裂解铜绿假单胞菌的能力比对照显著提高。

41、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

42、本发明从污水宏基因组测序数据中挖掘新型的噬菌体内溶素，发现一种新型内溶素sw16，经过工程改造过的新型内溶素可以高效裂解铜绿假单胞菌。新型的内溶素的发现不仅具有重要的理论研究意义，同时也将为临床治疗多重耐药菌提供新的选择。