一种在体外模拟腹腔热灌注化疗药物作用的方法与流程

本发明属于医药，具体涉及一种在体外模拟腹腔热灌注化疗药物作用的方法。

背景技术：

1、腹膜肿瘤是一种治疗难度很大、预后较差的恶性肿瘤，其主要分为两种类型：一是从腹膜自身发展而来的原发性肿瘤，二是由消化道或生殖系统癌症转移到腹腔形成的继发性肿瘤。由于“血液—腹膜屏障”可以阻断亲水性药物向肿瘤组织的扩散，从而降低化疗药物的有效作用浓度；因此，过去大多数腹膜肿瘤患者只能选择进行姑息治疗。

2、1980年，spratt等提出“腹腔热灌注化疗”(intraperitoneal hyperthermicperfusion chemotherapy，ihpc)的概念，其主要是通过高温对肿瘤的直接杀伤效应、以及高温与化疗药物抗肿瘤的协同作用和机械冲洗作用等。后续临床研究进一步证实：正常组织细胞能耐受45℃高温，而肿瘤细胞在40℃-43℃就会死亡。大多数化疗药物和高温的抗癌协同作用在39℃开始出现并随着温度的升高而逐渐增强；但43℃以上的高温将对机体产生热损伤，此时温度越高，热损伤作用反而越严重，相应热灌注化疗后并发症的发生率越高，而不高于43℃的热灌注化疗对术后并发症的发生率无明显影响。

3、热灌注化疗方法发展至今，经历数次技术革新和迭代。第一代的“灌注液加热后直接灌注法”，因为控温效果不佳导致疗效不稳定；第二代的“内生场持续加热灌注法”，由于温度分布不均，增加皮肤热损伤的风险；第三代的“恒温水浴箱或微波持续升温灌注法”，可控性差、临床治疗效果不理想；第四代“高精度持续循环热灌注法”，整体评价比较理想，但是成本也相应较高。

4、临床上对腹膜肿瘤患者的治疗方案还停留在按照医生经验指导用药的阶段：对患者行细胞减灭术后，先使用生理盐水或者单个常规化药进行灌注，维持管道通畅；后续再进行其他化药的单次或多次灌注。此外，热灌注化疗通常须在术后一周之内开始，以避免组织粘连发生导致的灌注效果下降。

5、随着肿瘤精准医学的不断进步，基于患者个体化用药指导的评价模型应运而生，比如人源肿瘤组织异种移植模型(patient-derived tumor xenograft,pdx)，患者来源的肿瘤类器官模型(patient-derived organoid,pdo)等。最近有文献报道，利用pdo模型在体外进行高温孵育，以测定药物的杀伤效率，此过程需要1个月左右。然而，目前还没有一个体外药敏检测模型能够在短时间内(小于1周)完成对热灌注化疗效果的预判，并且相关的临床应用研究也较为欠缺。

6、总的来说，热灌注化疗能够很好地改善腹膜肿瘤患者的预后状况、延长患者的生存期。其一，使化疗药物直接与肿瘤细胞接触，提升局部的有效药物作用浓度和时间；其二，可以降低药物进入体循环的剂量，从而减轻化疗所带来的副作用影响。但是，目前临床上主要依靠医生的经验、参考指南来给患者建议，缺乏个体化、精准化的用药指导策略。特别是对于复发耐药的患者来说，所能选用的常规药物数量有限。因此，亟需一种在体外能够模拟热灌注过程，并且精准预测热灌注化疗药物效果的检测方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的是现有肿瘤模型pdx/pdo等在腹膜肿瘤临床研究中应用受限的问题，通过体外建立新的微肿瘤模型来模拟腹腔热灌注化疗过程，精准预测热灌注化疗药物效果。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种构建腹膜肿瘤的微肿瘤模型的方法。

3、本发明提供的构建腹膜肿瘤的微肿瘤模型的方法，包括如下步骤：

4、(a1)用样本解离液对腹膜肿瘤实体瘤组织进行解离处理；

5、(a2)利用培养基悬浮培养步骤(a1)解离出来的单细胞，形成细胞团，即得腹膜肿瘤的微肿瘤模型；

6、(a1)中所述样本解离液由胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶iv、edta溶液和pbs组成；

7、(a2)中所述培养基由抗菌抗真菌剂三抗、hepes、glutamax、非必需氨基酸溶液、人重组蛋白egf、人重组蛋白bfgf、人重组蛋白hgf、人重组蛋白fgf-10、人重组蛋白wnt-3a、人重组蛋白noggin、人重组蛋白r-spondin、人重组蛋白il-2、人重组蛋白il-15、chir99021、sb202190、a83-01、primocin、n-乙酰-l-半胱氨酸、烟碱、n2supplement、霍乱毒素、b27、its-x、y-27632、胃泌素和advanced dmem/f12培养基组成；

8、其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200u/ml(如100u/ml)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/ml(如100μg/ml)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素b的终浓度为200-250ng/ml(如250ng/ml)；所述hepes的终浓度为8-12mm(如10mm)；所述glutamax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述非必需氨基酸溶液的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述人重组蛋白egf的终浓度为10-100ng/ml(如50ng/ml)；所述人重组蛋白bfgf的终浓度为10-50ng/ml(如20ng/ml)；所述人重组蛋白hgf的终浓度为5-25ng/ml(如20ng/ml)；所述人重组蛋白fgf-10的终浓度为5-25ng/ml(如20ng/ml)；所述人重组蛋白wnt-3a的终浓度为200-300ng/ml(如200ng/ml)；所述人重组蛋白noggin的终浓度为100-200ng/ml(如100g/ml)；所述人重组蛋白r-spondin的终浓度为250-500ng/ml(如400ng/ml)；所述人重组蛋白il-2的终浓度为10-100ng/ml(如20ng/ml)；所述人重组蛋白il-15的终浓度为10-100ng/ml(如20ng/ml)；所述chir99021的终浓度为1.5-6μm(如3μm)；所述sb202190的终浓度为5-10μm(如10μm)；所述a83-01的终浓度为0.25-1.25μm(如1μm)；所述primocin的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述n-乙酰-l-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)的终浓度为0.5-2mm(如1mm)；所述烟碱(nicotinamide)的终浓度为5-10mm(如10mm)；所述n2 supplement的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述霍乱毒素(cholera toxin)的终浓度为0.1-1nm(如1nm)；所述b27的终浓度为1.5-2.5％(体积百分含量，如2％)；所述its-x的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述y-27632的终浓度为5-20μm(如10μm)；所述胃泌素(gastrin)的终浓度为5-20nm(如10nm)；余量均为advanced dmem/f12培养基。

9、进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素b)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素b。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素b)为“antibiotic-antimycotic,100x”(如gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“antibiotic-antimycotic,100x”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素b，利用0.85％盐液形式的青霉素g(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素b作为抗真菌剂。

10、所述glutamax是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的l-谷氨酰胺。所述glutamax为“glutamaxtmsupplement”(如gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“glutamaxtmsupplement”的成分为l-alanyl-l-glutamine，是l-glutamine的替代物，浓度为200nm，溶剂为0.85％nacl溶液。

11、所述非必需氨基酸溶液的溶剂为水，溶质及浓度如下：甘氨酸10mm；l-丙氨酸10mm；l-天冬酰胺10mm；l-天冬氨酸10mm；l-谷氨酸10mm；l-脯氨酸10mm；l-丝氨酸10mm。

12、所述chir99021是一种高特异性的糖原合酶激酶-3(gsk-3)抑制剂，抑制gsk-3α和gsk-3β，ic50值分别为10nm和6.7nm。

13、所述primocin为原代细胞用抗菌剂(如invivogene#ant-pm-1，或与其组成相同的其他产品)，用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用。

14、所述n-2supplement为“n-2supplement(100x)”(如gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品)。所述“n-2supplement(100x)”中含有终浓度为1mm的人全铁转铁蛋白(humantransferrin(holo))、500mg/l的重组胰岛素全链(insulin recombinant fullchain)、0.63mg/l的孕酮(progesterone)、10mm的腐胺(putrescine)、0.52mg/l的亚硒酸盐(selenite)。

15、所述b27为“b-27tmsupplement(50x),minus vitamin a”(如gibco#12587010，或与其组成相同的其他产品)。所述“b-27tmsupplement(50x),minus vitamin a”中含有生物素(biotin)、dl-α-生育酚乙酸酯(dl alpha tocopherol acetate)、dl-α-生育酚(dlalpha-tocopherol)、bsa(fatty acid free fraction v)、过氧化氢酶(catalase)、人重组胰岛素(human recombinant insulin)、人转铁蛋白(human transferrin)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)、皮质酮(corticosterone)、d-半乳糖(d-galactose)、乙醇胺盐酸(ethanolamine hcl)、还原型谷胱甘肽(glutathione(reduced))、左旋肉碱盐酸(l-carnitine hcl)、亚油酸(linoleic acid)、亚麻酸(linolenic acid)、孕酮(progesterone)、腐胺(putrescine 2hcl)、亚硒酸钠(sodium selenite)、三碘甲状腺原氨酸(t3(triodo-i-thyronine))。

16、所述its-x的溶剂为ebss溶液(earle's平衡盐溶液)，溶质及浓度如下：胰岛素1g/l；转铁蛋白0.55g/l；亚硒酸钠0.00067g/l；乙醇胺0.2g/l。

17、所述y-27632为“y-27632dihydrochloride(一种atp竞争性的rock-i和rock-ii抑制剂，ki分别为220nm和300nm)”(如mce#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品)。

18、进一步地，所述培养基的存在形式可为如下a和b两种：

19、a.所述培养基为由所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素b)、所述hepes、所述glutamax、所述非必需氨基酸溶液、所述人重组蛋白egf、所述人重组蛋白bfgf、所述人重组蛋白hgf、所述人重组蛋白fgf-10、所述人重组蛋白wnt-3a、所述人重组蛋白noggin、所述人重组蛋白r-spondin、所述人重组蛋白il-2、所述人重组蛋白il-15、所述chir99021、所述sb202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑)、所述a83-01(3-(6-methyl-2-pyridinyl)-n-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1h-pyrazole-1-carbothioamide)、所述primocin、所述n-乙酰-l-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine)、所述烟碱(nicotinamide)、所述n2 supplement、所述霍乱毒素(cholera toxin)、所述b27、所述its-x(insulin,transferrin,selenium,ethanolamine solution)、所述y-27632、所述胃泌素(gastrin)和所述advanced dmem/f12培养基混合而成的溶液。

20、所述培养基配制好后需用0.22μm针头式滤器(millipore slgp033rs)过滤除菌，在4℃可以保存两周。

21、b.所述培养基中的各组分单独存在，使用时按照配方进行配制。

22、更进一步地，其中的人重组蛋白egf、人重组蛋白bfgf、人重组蛋白hgf、人重组蛋白fgf-10、人重组蛋白wnt-3a、人重组蛋白noggin、人重组蛋白r-spondin、人重组蛋白il-2、人重组蛋白il-15可以储液(母液)形式存在(-80℃可长期保存)，具体可为1000倍储液(母液)。sb202190、n-acetyl-l-cysteine、nicotinamide、y-27632和gastrin可以储液(母液)形式存在(-20℃可长期保存)，具体可为1000倍储液(母液)。chir99021和choleratoxin可以储液(母液)形式存在(-20℃可长期保存)，具体可为10000倍储液(母液)。a83-01可以储液(母液)形式存在(-20℃可长期保存)，具体可为100000倍储液(母液)。

23、1000×人重组蛋白egf储液由人重组蛋白egf、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白egf的终浓度为20μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

24、1000×人重组蛋白bfgf储液由人重组蛋白bfgf、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白bfgf的终浓度为20μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

25、1000×人重组蛋白hgf储液由人重组蛋白hgf、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白hgf的终浓度为20μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

26、1000×人重组蛋白fgf-10储液由人重组蛋白fgf-10、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白fgf-10的终浓度为20μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

27、1000×人重组蛋白wnt-3a储液由人重组蛋白wnt-3a、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白wnt-3a的终浓度为200μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

28、1000×人重组蛋白noggin储液由人重组蛋白noggin、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白noggin的终浓度为100μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

29、1000×人重组蛋白r-spondin储液由人重组蛋白r-spondin、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白r-spondin的终浓度为250μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

30、1000×人重组蛋白il-2储液由人重组蛋白il-2、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白il-2的终浓度为20μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

31、1000×人重组蛋白il-15储液由人重组蛋白il-15、bsa和pbs组成，其中所述人重组蛋白il-15的终浓度为20μg/ml，所述bsa的终浓度为0.01g/ml，余量均为pbs。

32、上述九种1000倍储液中，所述bsa是可以100倍储液(母液)形式存在(现配现用)，具体由bsa和pbs组成，其中bsa(sigma#a1933)的终浓度为0.1g/ml，余量均为pbs。

33、另外，10000×chir99021储液由chir99021和dmso组成，其中所述chir99021的终浓度为30mm，余量均为dmso。

34、1000×sb202190储液由sb202190和dmso组成，其中所述sb202190的终浓度为10mm，余量均为dmso。

35、100000×a83-01储液由a83-01和dmso组成，其中所述a83-01的浓度为25mm，余量均为dmso。

36、1000×n-acetyl-l-cysteine储液由n-acetyl-l-cysteine和超纯水组成，其中所述n-acetyl-l-cysteine的浓度为0.5m，余量均为超纯水。

37、1000×nicotinamide储液由nicotinamide和超纯水组成，其中所述nicotinamide的浓度为5m，余量均为超纯水。

38、10000×cholera toxin储液由cholera toxin和cholera toxin溶解液组成，其中所述cholera toxin的终浓度为10μm，余量均为cholera toxin溶解液。所述cholera toxin溶解液组成如下：每10ml所述cholera toxin溶解液中含有tris(1m)ph 7.00.05m，nacl0.2m，叠氮化钠3mm，edta(0.5m)ph 8.0 1mm，余量均为超纯水。

39、1000×y-27632由y-27632和超纯水组成，其中y-27632的终浓度为10mm，余量均为超纯水。

40、1000×胃泌素(gastrin)储液由胃泌素(gastrin)和超纯水组成，其中gastrin的终浓度为10μm，余量均为超纯水。

41、上述构建方法中，步骤(a1)中，所述解离处理是按照包括如下步骤：按1ml所述样本解离液不超过0.5mg组织的用量，将剪碎后的所述腹膜肿瘤实体瘤组织用所述样本解离液在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至2小时。

42、上述构建方法中，步骤(a2)中，所述培养基悬浮培养(a1)解离出来的细胞是按照包括如下步骤：使用低吸附表面的细胞培养容器，利用所述培养基悬浮培养(a1)解离出来的细胞，37℃，5％co2条件下进行培养。

43、其中，初始接种密度可为105个/cm2容器底面积，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板。

44、进一步地，步骤(a2)中培养的时间为2-3天。

45、上述构建方法中，在步骤(a1)之前，还包括如下对所述腹膜肿瘤实体瘤组织进行解离前处理的步骤：用体积百分含量为70-75％的乙醇清洗腹膜肿瘤实体瘤组织样本表面；用所述样本清洗液和无菌的pbs溶液先后清洗所述腹膜肿瘤实体瘤组织样本。其中用无菌的pbs溶液清洗所述腹膜肿瘤实体瘤组织样本5-10次(如5次)；然后除去所述腹膜肿瘤实体瘤组织样本中的杂质、结缔组织、脂肪组织、坏死组织等影响原代细胞培养的成分。对所述腹膜肿瘤实体瘤组织进行解离前处理的步骤需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

46、上述构建方法中，进行所述解离前处理的所述腹膜肿瘤实体瘤组织样本的离体时间为12小时以内，且在进行所述解离前处理之前一直保存于样本保存液中，所述样本保存液由胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、hepes溶液和hbss组成。

47、本发明中，所述样本保存液可用于样本离体后的暂时保存，可以在有样本离体后，短时间内维持样本中细胞的活性。所述样本保存液配制好后4℃可保存1个月。

48、本发明中，所述样本保存液由胎牛血清、双抗p/s、hepes和hbss组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为1-5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述双抗p/s中的青霉素的终浓度为100-200u/ml(如100u/ml)；所述双抗p/s中的链霉素的终浓度为100-200μg/ml(如100μg/ml)；所述hepes的终浓度为8-12mm(如10mm)；余量均为hbss。

49、本发明中，所述样本清洗液可用于样本的清洗和消毒。所述样本清洗液需现配现用。

50、在本发明的具体实施例中，所述样本清洗液由双抗p/s和pbs组成；其中，所述双抗p/s中的青霉素的终浓度为100-200u/ml(如100u/ml)；所述双抗p/s中的链霉素的终浓度为100-200μg/ml(如100μg/ml)；余量均为pbs。

51、本发明中，所述样本解离液可用于样本的解离。所述样本解离液需现配现用，其中的胶原酶i、胶原酶ii和胶原酶iv可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为10倍储液(母液)。10×胶原酶i储液由所述胶原酶i和pbs组成；其中所述胶原酶i的终浓度为2000u/ml；余量均为pbs。10×胶原酶ii储液由所述胶原酶ii和pbs组成；其中所述胶原酶ii的终浓度为2000u/ml；余量均为pbs。10×胶原酶iv储液由所述胶原酶iv和pbs组成；其中所述胶原酶iv的终浓度为2000u/ml；余量均为pbs。所述胶原酶i、所述胶原酶ii和所述胶原酶iv的酶活定义见后文。

52、所述样本解离液由胶原酶i、胶原酶ii、胶原酶iv和pbs组成；其中，所述胶原酶i的终浓度为150-250u/ml(如200u/ml)；所述胶原酶ii的终浓度为150-250u/ml(如200u/ml)；所述胶原酶iv的终浓度为150-250u/ml(如200u/ml)；余量均为pbs。

53、其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶i或所述胶原酶ii或所述胶原酶iv)的单位u：在37℃，ph 7.5的条件下，用1u蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶i或所述胶原酶ii或所述胶原酶iv)5小时，可以释放l-亮氨酸1μmol。

54、本发明中，所述细胞消化液可用于细胞团块的消化和传代，可以将腹膜肿瘤的微肿瘤模型再消化成单个细胞。所述细胞消化液需现配现用。

55、所述细胞消化液组成如下：每10ml所述细胞消化液中含有4-6ml(如5ml)accutase，终浓度为5mm的edta，1.5-2.5ml(如2ml)tryple express，余量为pbs。

56、进一步地，所述accutase为“stemprotmaccutasetmcell dissociation reagent”(如gibco#a11105-01，或与其组成相同的其他产品)。所述accutase是一种单一成分的酶，在d-pbs，0.5mm edta溶液中溶解。所述tryple express为“trypletmexpress enzyme(1x),no phenol red”(如gibco#12604013，或与其组成相同的其他产品)。所述“trypletmexpressenzyme(1x),no phenol red”中含有200mg/l的kcl、200mg/l的kh2po4、8000mg/l的nacl、2160mg/l的na2hpo4·7h2o、457.6mg/l的edta；还含有重组蛋白酶。

57、上述方法中，在步骤(a1)中，用所述样本解离液对所述腹膜肿瘤实体瘤组织进行解离处理后还包括如下步骤：用消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；离心后用无菌pbs重悬细胞；再离心，然后用前文所述方法中的培养基重悬细胞沉淀。

58、本发明中，所述消化终止液可用于终止样本解离或细胞消化过程。所述消化终止液配制好后可在4℃保存一个月。

59、所述消化终止液由胎牛血清、双抗p/s和dmem培养基组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为8-12％(如10％，％表示体积百分含量)；所述双抗p/s中的青霉素的终浓度为100-200u/ml(如100u/ml)；所述双抗p/s中的链霉素的终浓度为100-200μg/ml(如100μg/ml)；余量均为dmem培养基。

60、所述细胞冻存液由advanced dmem/f12培养基、dmso和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述advanced dmem/f12培养基、所述dmso和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)(如20:2:1)；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。

61、前文所述构建腹膜肿瘤的微肿瘤模型的方法中所用的培养基也属于本发明要求保护的范围。

62、本发明还要求保护一种用于培养腹膜肿瘤微肿瘤模型的成套试剂。

63、本发明要求保护的用于培养腹膜肿瘤微肿瘤模型的成套试剂，由前文所述构建腹膜肿瘤的微肿瘤模型的方法中所述培养基和如下中的全部或部分组成：样本解离液、样本保存液、样本清洗液、细胞消化液、消化终止液和细胞冻存液组成。

64、本发明还提供了前文所述的方法在制备腹膜肿瘤的微肿瘤模型和/或制备用于构建腹膜肿瘤的微肿瘤模型的产品中的应用。

65、本发明还提供了前文所述的培养基在制备腹膜肿瘤的微肿瘤模型和/或制备用于构建腹膜肿瘤的微肿瘤模型的产品中的应用。

66、本发明还提供了一种体外模拟热灌注化疗过程的方法，包括以下步骤：

67、(1)使用前文所述的方法悬浮培养得到腹膜肿瘤的微肿瘤模型；

68、(2)选择需要检测的化疗药物并稀释到合适的工作浓度，加入到对应的检测孔中；

69、(3)对(2)中的检测孔进行恒温加热；

70、(4)进行微肿瘤面积大小和/或细胞活力高低的测量，获得实验结果。

71、本发明还提供了一种获得腹膜肿瘤实体瘤原代细胞的方法，是从利用前文所述方法得到的腹膜肿瘤微肿瘤模型中分离得到腹膜肿瘤实体瘤原代细胞。具体可包括如下步骤：

72、(b1)采用细胞消化液(如前文所述细胞消化液)对所述腹膜肿瘤微肿瘤模型进行消化处理，得到单细胞；

73、进一步地，还包括终止消化的步骤。如采用前文所述消化终止液终止消化。

74、(b2)将步骤(b1)所得单细胞，均匀铺在贴壁的培养皿上，即得所述腹膜肿瘤实体瘤原代细胞系。

75、本发明中，所述腹膜肿瘤具体可为腹膜间皮瘤、腹膜假性黏液瘤、腹膜肉瘤等，腹膜肿瘤样本重量超过50mg。

76、本发明中，以上所有的所述pbs均可为1×pbs，ph7.3-7.5。其具体组成如下：溶剂为水，溶质及浓度为：kh2po4 144mg/l，nacl 9000mg/l，na2hpo4·7h2o 795mg/l。

77、本发明提供了一种从新鲜腹膜肿瘤实体瘤组织中提取培养腹膜肿瘤微肿瘤模型的方法和配套试剂，该方法具有以下优点：1.组织样本用量少，仅需50mg左右的腹膜肿瘤手术样本；2.培养和检测周期短，仅需1-3天即可培养成功，且只需5-7天即可得到药敏结果；3.培养稳定性高，用本方法对合格的腹膜肿瘤手术标本进行体外培养的成功率高达90％；4.细胞类型丰富，腹膜肿瘤微肿瘤模型可以保存原病灶中的肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞等多种细胞类型，很好地再现肿瘤微环境；5.临床一致性高，用本方法在体外测到的药敏结果可以精准预测患者热灌注化疗的效果。

78、临床上腹膜肿瘤的患者需要行腹腔热灌注化疗，其对药物的选择目前依靠医生临床经验和指南参考，因此部分患者可能无法从中获得治愈。本发明建立基于微肿瘤模型的热灌注化疗作用模拟体系，旨在帮助患者在体外进行试药，为患者提供更加个性化、精准化的用药指导建议。