茶假拟盘多毛孢的LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种茶假拟盘多毛孢的lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术：

1、茶树（ camellia sinensis（l.）o. ktze.）属山茶科山茶属多年生常绿木本植物，是我国最重要的经济作物之一。茶树在栽培过程中常常受到多种病原菌侵染，不仅造成树势衰弱、茶叶减产，而且还造成茶叶品质下降。茶树叶部病害可直接造成茶叶减产，因此一直是研究热点。茶轮斑病是茶树叶部主要病害之一，其病原主要为类拟盘多毛孢真菌（ pestalotiopsis-like fungi），该类真菌又归为三个属：拟盘多毛孢属（ pestalotiopsis）、假拟盘多毛孢属（ pseudopestalotiopsis）和新拟盘多毛孢属（ neopestalotiopsis），危害茶树的病原种类达27个种以上，其中茶假拟盘多毛孢 ps.  camelliae-sinensis是优势致病种之一。

2、对茶树叶部病原真菌的鉴定，主要依赖于形态学特征结合多基因序列分析，再辅以田间症状进行种类鉴定，但都以纯培养物为基础，分离纯化病原菌费时费力，在病害流行暴发时，不利于快速鉴定，易错过最佳防控时机。近年来，随着植物病原分子检测技术的快速发展，可直接用病斑组织进行检测，而不需要病原菌纯培养，这样极大地缩短鉴定时间。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，lamp）lamp检测技术就是其中一种。该技术具有不依赖专门仪器设备、操作简便、特异性强、灵敏度高和结果易于判断等优点，正广泛应用于植物病原菌快速检测中。目前，关于茶轮斑病的病原茶假拟盘多毛孢 pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis的快速检测lamp技术未见报道。因此，为解决传统技术中依赖病原菌的纯培养物进行形态学特征结合多基因序列分析存在耗时费力等问题，本发明的目的是提供一种快速检测茶假拟盘多毛孢 ps. camelliae-sinensis的lamp引物及检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种茶假拟盘多毛孢的lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法和应用，具体采用以下的技术方案：

2、本发明的第一方面，提供了一种茶假拟盘多毛孢的lamp检测引物组，该lamp引物组包括外引物对、内引物对和环引物；

3、上述外引物对包括psf3和psb3：上述内引物对包括psfip和psbip；上述环引物为pslf；各引物序列如下：

4、psf3：5'-tcccaataggaagccgcc-3'；

5、psb3：5'-gccatgttagtcaccagtca-3'；

6、psfip：5'-gataccacgctcacgctcgg-aagggttccttcaagtacgc-3'；

7、psbip：5'-cgctctctggaagttcgagacc-tgagggcagggaacacta-3'；

8、pslf：5'-ctgtggcaagagttacctgc-3'。

9、其中，上述茶假拟盘多毛孢 ps. camelliae-sinensislamp检测特异性引物设计包括以下步骤：

10、选择茶假拟盘多毛孢 ps. camelliae-sinensis和其他茶树病原菌的 tef1基因片段，采用在线lamp引物设计软件primer explorer v5设计引物，综合考量引物长度、gc含量、tm、dg（3'dg 和5'dg）等参数范围；通过dnastar软件、blast搜索引物扩增片段，分析引物特异性；获得 ps. camelliae-sinensis特异性lamp引物组，由外引物psf3和psb3，内引物psfip(f1c+f2)和psbip (f1c+b2)组成；根据筛选的引物扩增区，生成环引物pslf。

11、作为进一步优选的实施方式，上述外引物对、所述内引物对和环引物在反应体系中的摩尔比为1-2：6-10：3-6。

12、本发明的第二方面，还提供了一种茶假拟盘多毛孢的lamp检测试剂盒，其包含上述茶假拟盘多毛孢的lamp检测引物组。

13、作为进一步优选的实施方式，上述茶假拟盘多毛孢的lamp检测试剂盒还包括基因组dna提取液、lamp反应缓冲液、钙黄绿素、dna聚合酶；所述dna聚合酶为bst dna聚合酶。其中，lamp反应缓冲液包括dntps（脱氧核苷酸）、tris-hcl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）、kcl、(nh4)2so4、mgso4、betaine（甜菜碱）、tween 20（吐温-20）。

14、本发明的第三方面，还提供了上述假拟盘多毛孢的lamp检测试剂盒检测假拟盘多毛孢的方法，包括以下步骤：

15、s1、基因组dna提取：若检测样本为纯培养物时，则采用ctab法或商品化试剂盒提取待测样品基因组dna；若检测样本为病斑组织时，采用naoh快速裂解法提取dna；

16、s2、配制lamp反应体系：lamp反应体系中，检测引物组包括外引物psf3和psb3各5pmol，内引物psfip和psbip各40pmol，环引物pslf 20 pmol；lamp反应缓冲液包括2.0 mmdntps，40 mm tris-hcl，20 mm kcl，20 mm (nh4)2so4，16 mm mgso4，1.6 mm betaine，0.2%tween 20；钙黄绿素1.0 μl；8 u bstdna聚合酶1.0 μl；dna模板2.0 μl；最后用ddh2o补足至25 μl；

17、s3、lamp扩增：以步骤s1提取的dna为模板，利用所述检测引物组经扩增得到lamp扩增产物；

18、s4、扩增引物检测：扩增反应完毕后采用肉眼观察或者琼脂糖凝胶电泳法判定结果；

19、若采用肉眼观察：扩增反应结束后静置，通过肉眼观察反应液的颜色变化，当反应液由橙色变为黄绿色时为阳性，即为茶假拟盘多毛孢 ps. camelliae-sinensi存在，当反应液无变化则为阴性，即无茶假拟盘多毛孢 ps. camelliae-sinensi存在；

20、若采用琼脂糖凝胶电泳法：取lamp扩增产物2.0 μl，用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察到典型的梯状条带则表示阳性，否则为阴性。

21、作为进一步优选的实施方式，上述采用ctab法或商品化试剂盒提取待测样品基因组dna的具过程如下：

22、采用ctab法或商品化试剂盒提取待测样品基因组dna，无菌去离子水（ddh2o）洗脱溶解dna，得到基因组dna提取液。检测样品时采用超微量分光光度计检测dna浓度，并配置成100 ng·μl-1。

23、作为进一步优选的实施方式，上述采用naoh快速裂解法提取dna的具体过程如下：

24、向每克含有病斑的植物组织中入10 µl，浓度为0.5 mol·l-1的naoh溶液，在液氮下将组织充分磨碎成糊后转入1.5 ml离心管中，12000 rpm离心6 min，取上清液5 µl与495µl，浓度为0.1 mol ·l-1，ph为8.0的tris-hcl混合均匀，得到基因组dna提取液。

25、作为进一步优选的实施方式，上述lamp反应条件为：在63℃下恒温反应45min进行lamp体系扩增，然后在95℃下恒温反应2min后终止反应。

26、本发明的第三方面，还提供了上述茶假拟盘多毛孢的lamp检测引物组能够作为茶假拟盘多毛孢的lamp扩增引物应用在检测茶假拟盘多毛孢中。

27、本发明的有益效果为：本发明提供了一种检测引物组和检测方法，其既可对病原菌纯培养物 ps. camelliae-sinensis进行快速诊断，也可直接对茶树叶部早期病斑进行快速检测，避免了现有技术中在检测时对pcr等贵重仪器设备的依赖问题，而且本发明提供的方法具有检测特异性高、灵敏度高、检测时间短、肉眼直接观察结果等优势，为基层植保机构在茶苗移栽、调运中应用提供了依据和支撑，具有广泛和实际的应用价值。