一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法与流程

本发明涉及微生物，具体涉及一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法。

背景技术：

1、出芽短梗霉(aureobasidium pullulans)是一种具有酵母型和菌丝形态的的多型真菌，其形态较黏菌相对稳定，合成pmla的能力也相对较强。出芽短梗霉合成的pmla分为两部分，其中一部分以β-pmla-葡聚糖结合体的形式分泌，另一部分被分解为自由β-pmla分泌到细胞外。

2、聚苹果酸又名聚羟基丁二酸酯，是一种具有良好生物相容性及生物降解性的水溶性脂肪族聚酯类化合物，pmla是以重复的l-苹果酸为单体，通过-oh和α-或β-cooh形成的酯键聚合而成，主要有三种构型：α型、β型、γ型。

3、目前，聚苹果酸的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有开环聚合法和直接聚合法，可以得到3种构型的pmla，其中开环聚合法技术较为成熟。但与生物合成法相比，化学法合成的pmla分子量较小，合成步骤长，提纯工艺复杂，严重制约了其规模化发展。微生物合成法是由微生物体内通过三羧酸循环代谢仅存有β-型，能得到相对分子量较大的pmla，且具有较高的化学纯度和光学纯度，性能优异。

4、pmla发酵培养基的主要成分有碳源、氮源、无机盐和有机酸，碳源和氮源是微生物生长代谢得主要营养物质，低浓度的无机盐能够促进细胞的生长和产物合成。

5、目前对出芽短梗霉发酵产聚苹果酸的研究主要集中在发酵菌株的筛选和产量的提高上，公开号cn105624218a的发明专利通过改善细胞膜通透性，添加ctte和dmso组成的活性剂，结合阶段控温的方法使聚苹果酸产量提高40%。公开号cn103045662b的发明专利通过优化氨基酸、胆碱和嘌呤嘧啶生长因子复配代替传统培养基中的蛋白胨，使聚苹果酸产量达到33-40g/l，并且降低了后续提取过程的脱色难度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，以复合诱变后的出芽短梗霉发酵生产β-pmla的基础工艺上进行深入研究，实现β-聚苹果酸产量和分子量的最大化和工艺的最优化。

2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供的一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，包括以下步骤：

4、（1）菌种诱变：以出芽短梗霉菌为出发菌种，采用甲基磺酸乙酯+紫外照射复合诱变，获得正向突变的稳定菌株；

5、（2）菌种活化：将（1）中诱变得到的菌种用接种环转接到新鲜pda斜面培养基上，25℃恒温培养4-5天；

6、（3）种子培养：用无菌水将斜面上的孢子制成孢子悬液，将孢子悬液按10%v/v接种量接种到种子培养基中进行培养，得到种子培养液；

7、（4）发酵培养：将（3）中种子培养液按10%v/v接种量接种到基础发酵培养基中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养6-8d，得到聚苹果酸发酵液。

8、进一步的，步骤（3）中种子培养基的培养条件为摇床转速220-250rpm，25℃培养48h。

9、进一步的，步骤（3）中种子培养基的组成g/l为：蔗糖60.0，酵母膏3.0，丁二酸2.0，硫酸铵1.0，k2co30.4，kh2po40.1，mgso4•7h2o 0.1，znso4•7h2o 0.005，玉米浆0.1%，caco320.0。

10、进一步的，步骤（4）中基础培养基的组成g/l为：蔗糖100.0，蛋白胨35.0，kh2po40.1，nano32.0，mgso4·7h2o 0.3，kcl 0.5，mgso40.05，caco320.0。

11、进一步的，步骤（4）中发酵培养基碳源为蔗糖、葡萄糖、木糖中的一种，氮源为硝酸钠、尿素、硫酸铵和丁二酸铵中的一种。

12、进一步的，步骤（4）中发酵培养基的组成为：100 g/l葡萄糖，35 g/l蛋白胨，2 g/l丁二酸铵，0.1 g/l kh2po4，0.3 g/l mgso4·7h2o，0.5 g/l kci，0.05 g/l mgso4。

13、进一步的，步骤（4）中发酵培养基中还添加有0.5~0.8g/l亮氨酸。

14、进一步的，所述聚苹果酸分子量在8000~9200，产量在28~41g/l。

15、进一步的，所述 ems浓度0.4mol/l，作用时间35min；所述紫外为30w紫外灯照射时间120s，照射距离30cm。

16、进一步的，步骤（3）中发酵培养基中还添加有0.5~0.8g/l亮氨酸。

17、基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：

18、（1）本发明提供的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，采用生物发酵法减少了化学法对环境的污染，降低生产成本，同时通过优化碳源、氮源的种类，添加适量的亮氨酸也有助于提高出芽短梗霉发酵法生产聚苹果酸的产量及分子量，为后续工业化生产提供有利条件。

19、（2）本发明提供的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，聚苹果酸产量在28~41g/l，分子量在8000~9200 da。

技术特征：

1.一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（3）中种子培养基的培养条件为摇床转速220-250rpm，25℃培养48h。

3. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（3）中种子培养基的组成g/l为：蔗糖60.0，酵母膏3.0，丁二酸2.0，硫酸铵1.0，k2co3 0.4，kh2po4 0.1，mgso4•7h2o 0.1，znso4•7h2o 0.005，玉米浆0.1%，caco3 20.0。

4. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中基础培养基的组成g/l为：蔗糖100.0，蛋白胨35.0，kh2po4 0.1，nano3 2.0，mgso4·7h2o 0.3，kcl 0.5，mgso4 0.05，caco3 20.0。

5.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵培养基碳源为蔗糖、葡萄糖、木糖中的一种，氮源为硝酸钠、尿素、硫酸铵和丁二酸铵中的一种。

6. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵培养基的组成为：100 g/l葡萄糖，35 g/l蛋白胨，2 g/l丁二酸铵，0.1g/l kh2po4，0.3 g/l mgso4·7h2o，0.5 g/l kci，0.05 g/l mgso4。

7.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（4）中发酵培养基中还添加有0.5~0.8g/l亮氨酸。

8.根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，所述聚苹果酸分子量在8000~9200，产量在28~41g/l。

9. 根据权利要求1所述的基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，其特征在于，所述 ems浓度0.4mol/l，作用时间35min；所述紫外为30w紫外灯照射时间120s，照射距离30cm。

技术总结
本发明公开了一种基于出芽短梗霉发酵制备高聚合度聚苹果酸的方法，包括以下步骤：（1）诱变；（2）菌种活化：将菌种转接到斜面培养基上，25℃恒温培养4‑5d；（3）种子培养：用无菌水将斜面上的孢子制成孢子悬液，将孢子悬液接种到种子培养基中进行培养，得到种子培养液；（4）发酵培养：将种子培养液接种到基础发酵培养基中培养，接种至灭菌后的发酵培养基中，25℃培养6‑8d，得到聚苹果酸发酵液。本发明采用生物发酵法减少了化学法对环境的污染，降低生产成本，同时通过优化碳源、氮源的种类，添加适量的亮氨酸也有助于提高出芽短梗霉发酵法生产聚苹果酸的产量及分子量，为后续工业化生产提供有利条件。

技术研发人员：康建平,李佳逸,谭昕,何雨静,何勇,王燕来
受保护的技术使用者：四川省纺织科学研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11