本发明涉及荧光探针,特别涉及一种特异性检测丙氨酸的荧光探针及其制备方法与检测方法。
背景技术:
1、d-丙氨酸(d-ala)广泛分布于哺乳动物体内,通过d-ala的有限数据,表明它作为精神分裂症的治疗剂的潜力,d-ala可作为药物来治疗由五氯苯酚引起的多动和其他行为的影响。d-ala还对缺血再灌注所致肾损伤具有保护作用。并且通过数据表明d-ala是一个有吸引力的治疗靶点和一个潜在的识别急性肾损伤生物标志物,除此之外,在严重的病毒感染中,血液中包括d-ala在内的d型氨基酸水平降低,补充d-丙氨酸可以改善预后,d-ala为一种生物标志物和治疗严重病毒感染的选择具有巨大潜力。
2、目前,检测d-ala的方法有很多种,传统的检测方法包括高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等,这些方法的不足之处在于仪器设备昂贵、操作繁琐、灵敏度低。相对来说,荧光传感技术具有高选择性、高灵敏度、低检测限、操作简单等优点,利用荧光探针特异性识别d-ala是一种值得推广的方法。因此,亟需一种具有专一选择性、灵敏度高、检测浓度范围广等优点的荧光探针来检测d-ala。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种特异性检测丙氨酸的荧光探针及其制备方法与检测方法,通过提出一种可以特异性识别水相中高浓度d-ala的荧光探针的结构,以实现该荧光探针在人体内的20种氨基酸中特异性地识别d-ala,使其具有特异选择性、灵敏度高、检测浓度范围广的优点。
2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
3、一种特异性检测丙氨酸的荧光探针,所述荧光探针是以binol为骨架,其结构如式(1)所示:
4、
5、本发明还提供一种特异性检测丙氨酸的荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
6、步骤1、合成(r)-2:
7、将(r)-1分散在无水thf中,在0℃下加入到nah分散在无水thf中的溶液,室温反应2小时,在0℃下加入溴甲基甲基醚,室温反应过夜,0℃下加入h2o淬灭反应,用乙酸乙酯分离水相有机相,除去溶剂后将产物重结晶得到白色固体产物(r)-2;
8、步骤2、合成(r)-3:
9、在0℃下向(r)-2的thf溶液中加入n-buli,反应1小时后0℃加入适量dmf,室温反应3小时后加入饱和氯化铵溶液淬灭反应,分离水相有机相,减压除去溶剂后经硅胶柱纯化得黄色产物(r)-3;
10、步骤3、合成(r)-4:
11、将(r)-3溶于dcm和无水乙醇的混合溶液中,加入适量hcl,反应过夜,加入固体nahco3淬灭,加入dcm萃取,分离水相有机相,减压除去溶剂后经硅胶柱纯化得到黄色固体产物(r)-4;
12、步骤4、合成(r)-5:
13、将(r)-4、盐酸羟胺溶于dcm和无水乙醇的混合液中充分搅拌,加入适量三乙胺,升温80℃冷凝回流反应过夜,充分反应后经硅胶柱纯化得到淡黄色固体(r)-5。
14、进一步优选:步骤2中,柱色谱提纯时所用洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
15、进一步优选:步骤4中,柱色谱提纯时所用洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
16、本发明还提供一种特异性检测丙氨酸的荧光探针的检测方法,荧光探针(r)-5溶于dmso中制得0.8mm/l的母液1,将氨基酸溶于稀释后的四丁基氢氧化铵溶液中反应2h制得24mm的母液2,将乙酸锌溶于超纯水中制得1.6mm的母液3,从母液1、母液2各取50μl溶液,添加到新的样品瓶中,加入250μl乙腈,随后从母液3中取50μl溶液加入样品瓶,立即混合均匀并反应三小时,反应结束后用乙腈定容至4ml。
17、综上所述,本发明具有以下有益效果:
18、本发明提出了一种可以特异性识别水相中高浓度d-ala荧光探针的结构,以实现该荧光探针在人体内的20种氨基酸中特异性地识别d-ala,使其具有特异选择性、灵敏度高、检测浓度范围广等优点。
1.一种特异性检测丙氨酸的荧光探针,其特征在于:所述荧光探针是以binol为骨架,其结构如式(1)所示:
2.根据权利要求1所述的一种特异性检测丙氨酸的荧光探针的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
3.根据权利要求2所述的一种特异性检测丙氨酸的荧光探针的制备方法,其特征在于:步骤2中,柱色谱提纯时所用洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
4.根据权利要求1所述的一种特异性检测丙氨酸的荧光探针的制备方法,其特征在于:步骤4中,柱色谱提纯时所用洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯=10:1,v/v。
5.根据权利要求1所述的一种特异性检测丙氨酸的荧光探针的检测方法,其特征在于:荧光探针(r)-5溶于dmso中制得0.8mm/l的母液1,将氨基酸溶于稀释后的四丁基氢氧化铵溶液中反应2h制得24mm的母液2,将乙酸锌溶于超纯水中制得1.6mm的母液3,从母液1、母液2各取50μl溶液,添加到新的样品瓶中,加入250μl乙腈,随后从母液3中取50μl溶液加入样品瓶,立即混合均匀并反应三小时,反应结束后用乙腈定容至4ml。