水稻转录因子OsWRKY66及其应用

本发明属于农业科学，涉及水稻转录因子oswrky66及其应用。

背景技术：

1、作物抗虫性的利用是农业防治的一个重要方向。应用抗虫性品种有效地压低甚至消灭害虫，是符合我国农作物绿色控虫这一重大战略需求，且具产业化前景的。当前对半翅目昆虫，如稻飞虱的防治策略则主要依赖于化学农药，而化学农药的长期过量使用已经对生态环境造成严重威胁。因此，通过基因工程技术培育抗稻飞虱水稻新品种是一种行之有效的绿色控虫策略。

2、纵观我国百余年的水稻育种历程，经历了矮化育种、杂种优势利用(三系法杂交水稻)和绿色超级稻(两系法杂交水稻)培育3次跨越式突破。每1次突破均是一些核心基因发挥了至关重要的作用，包括矮化基因sd1(程式华主编.中国超级稻育种[m].北京：科学出版社，2010.)、核质互作雄性不育恢复基因rf3和rf4(景润春,何予卿,黄青阳.水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因的issr和sslp标记分析[j].中国农业科学,2000,33(2):10-15)以及光温敏核不育基因pms3(梅明华，陈亮，章志宏，等.农垦58s光敏不育基因突变位点的确定及pms3区间的进一步作图[j].中国科学，1999，29(3)：6)，这极大地加速了我国育种业的发展，始终处于世界领先地位。近年来，研究发现其它一些基因，如抗稻瘟病基因pi(bryangt,wu ks,farrall l,et al.a single amino acid difference distinguishesresistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene pi-ta[j].the plant cell online,2000,12(11):2033-2046)、抗虫基因cry1ab/c(tu j,datta k,firoz am,fan y,et al.(1998).expression and function of a hybrid bt toxin genein transgenic rice conferring resistance to insect pest.plantbiotechnology.15,195–203.)、品质基因wx(gao zy,zeng dl,cui x,et al.map-basedcloning of the alk gene,which controls the gelatinization temperature of rice[j].china science c life,2003,46(6):661-668.)、粒型控制基因gw5(weng j,gu s,wanx,et al.isolation and initial characterization of gw5,a major qtl associatedwith rice grain width and weight[j].cell research,2008,18(12):1199-1209.)以及籼粳交杂种优势利用基因s5-n(mi jm,lei y,kim sr,et al.an effective strategy forfertility improvement of indica-japonica hybrid rice by pyramiding s5-n,f5-n,and pf12-j[j].molecular breeding,2019,39(9):1-13.)等在抗病虫、高产优质等方面表现优良，但尚未商业化推广应用。因此，挖掘更多关键基因对于聚合有利基因、培育优质高效和绿色轻简新品种需求迫切。

3、在褐飞虱中，国内外已经鉴定和报道了43个主效抗性基因，其中bph14、bph15、bph3、bph2/26、bph9/1/7/10/21、bph18、bph29、bph32、bph6已经被克隆研究(程式华主编.中国超级稻育种[m].北京：科学出版社，2010.)。考虑到将来若含有这些基因的抗虫水稻被大面积种植，选择压会导致新的昆虫抗性生物型的进化，从而严重威胁了作物抗性的持久性。因此，不断挖掘新的抗虫基因或许能帮助作物抗性品系在农业应用上保持其耐久性。先前文献结果表明，转录因子wrky家族可以正或者负调控植物抗性(zhen x,zhang zl,zouxl,et al.annotations and functional analyses of the rice wrky genesuperfamily reveal positive and negative regulators of abscisic acidsignaling in aleurone cells[j].plant physiology,2005 137(1):176–189.)，目前对于oswrky66的功能未知。

技术实现思路

1、发明目的：针对传统育种获得优良水稻突变体材料费时费力的缺点，本发明所要解决的技术问题是提供了转录因子oswrky66或含有所述转录因子的过表达载体或重组菌在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，实现抗虫水稻品种的精准高效选育。

2、本发明还要解决的技术问题是提供了一种获得具有褐飞虱抗性水稻的方法。

3、技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了转录因子oswrky66或含有所述转录因子的过表达载体在提高水稻对褐飞虱抗性中的应用，所述转录因子oswrky66的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、其中，所述过表达载体包括pegoepubi-h-ubi-oswrky66-gus。

5、其中，所述过表达载体pegoepubi-h-ubi-oswrky66-gus是将目的基因oswrky66通过同源重组方法构建到过表达载体pegoepubi-h-ubi-gus中得到。

6、本
技术实现要素：
还包括一种获得具有褐飞虱抗性水稻的方法，所述方法包括使水稻包含转录因子oswrky66或含有所述转录因子的过表达载体。

7、本发明oswrky66转录因子的过表达载体pegoepubi-h-ubi-oswrky66-gus遗传转化水稻日本晴后，显著提高了oswrky66的转录水平。

8、其中，所述方法具体包括如下步骤：将含有所述转录因子oswrky66的过表达载体转化至农杆菌感受态细胞中得到阳性菌，将阳性菌侵染野生型水稻的愈伤组织，移出该愈伤组织到共培养基中，20℃条件下培养48-72h后，接种到筛选培养基上，26℃暗培养20-30d后，挑取单克隆阳性愈伤组织接种到二次筛选培养基上，26℃暗培养7-10d后，将该阳性愈伤组织接种到分化培养基上，25-27℃光照培养15-20d，之后将分化出2-5cm的芽接种至生根培养基，30℃光照培养7-10d。

9、有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：本发明挖掘了wrky家族转录因子oswrky66的功能，从水稻基因组中找到编码该转录因子基因的完整cdna序列，构建到适用于单子叶水稻表达的过表达载体中，利用农杆菌侵染愈伤组织法获得转基因植株。对阳性转基因水稻进行目的基因转录水平、抗虫性以及表型差异测定。结果表明：oswrky66在转基因水稻oswrky66中过量表达，且显著提高了对褐飞虱的抗性。对于一些需要提高抗虫性的其它植物，可以通过导入该基因的方式培育一些新品种，对于植物育种具有重大的应用价值。