用于miRNA检测的通用茎环引物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及mirna检测，具体而言，涉及用于mirna检测的通用茎环引物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、microrna(mirna)，微小核糖核酸是一类进化上保守的长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链rna分子，由具有发卡结构70-90个碱基大小的单链前体rna(pre-mirna)剪切而成，在动植物体内通过与靶基因mrna的3'端互补结合抑制mrna的翻译和破坏mrna的稳定性来调控基因表达。大量的研究显示mirna在生物体生长发育、肿瘤的发生发展、病毒感染、免疫调控和炎症反应等过程发挥重要作用。

2、mirna较短的序列长度(约22nt)对其检测提出了较大的挑战。与mrna的常规实时荧光定量pcr技术有所不同，由于极短的序列长度mirna无法直接使用引物进行扩增检测，需要人为设计延长待测mirna序列长度再进行检测。目前常用的mirna荧光定量检测的方法主要有两种：加poly a尾法和茎环法。

3、目前，加poly a尾法在加ploy a尾酶的作用下可以将不同种类的mirna无差别加上poly a尾，延长了mirna的长度，再逆转录酶的作用下，逆转录引物结合到mirna模板上合成cdna模板。加poly a尾法可以提取纯化的样本中所有种类的mirna全部加poly a尾，属于高通量逆转录，一次逆转录可以检测多种mirna，但是由于其逆转录引物的通用性，其检测的灵敏度和特异性较差，无法检测低丰度拷贝的mirna，不能很好区分序列差异较小同源家族的mirna。

4、茎环法可以有效区分低至1个碱基差别的同源mirna，并且由于逆转录引物独特的茎环结构以及与靶标mirna特异性的互补序列，能够避免与双链的pre-mirna(mirna前体)退火结合。有研究显示定量精确性能够从低至25pg的总rna中检测到大多数的mirna，结合taqman荧光探针茎环法可以检测低至7个拷贝数的mirna，具有8个数量级极为宽广的线性检测范围。因此茎环法相较于加poly a尾法具有更高的检测灵敏度、特异性和准确性，但是不同的mirna的茎环引物的通用序列不仅能够自身互补配对形成发卡结构，茎环引物之间也会相互配对结合，造成不同mirna逆转录不充分进而影响qpcr的检测结果，因此使用茎环法建议一次逆转录检测一个mirna，对于多个靶标rna和内参的检测需要分别逆转录检测。内参与mirna分开，在两个或多个体系分别逆转录，容易产生误差，并且检测成本和时间成本均有显著增加。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于mirna检测的通用茎环引物、试剂盒及其应用从而解决mirna茎环法逆转录和检测通量低(或检测效率低)的问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种用于mirna检测的通用茎环引物，其包括如下至少一种：

4、依次如seq id no.1-4所示的茎环引物1、茎环引物2、茎环引物3和茎环引物4。

5、

6、上述4种通用茎环引物在使用时，可以使用其中的任意一种作为单重逆转录引物的茎环引物，进而用于单重pcr或多重pcr；也可使用其中的任意两种茎环引物作为双重逆转录引物的茎环引物，进而用于单重或多重pcr；也可以使用其中的任意三种茎环引物作为三重逆转录引物的茎环引物，进而用于单重或多重pcr；也可以使用四种茎环引物作为四重逆转录引物的茎环引物，进而用于单重或多重pcr。因此，本发明提供的通用茎环引物逆转录mirna的数量由1个提升至4个，结合不同荧光基团标记的taqman探针使得单个qpcr反应中可以检测多至4个mirna，即实现了mirna茎环法检测的多重逆转录和多重检测。

7、本发明中，茎环引物的设计利用了引物单链dna分子通过自身回折使得分子内部互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成稳定的发卡结构。不同的茎环引物发卡结构的稳定性有所不同，可能会导致不同茎环引物对mirna的逆转录效率有所差异。通过分析常用的通用茎环引物序列和本发明所设计的四种不同茎环引物序列形成的发卡结构和能量变化来比较其对逆转录过程的影响。对本发明中四种茎环引物参数和结构进行分析，四种茎环引物序列的参数分析显示：引物的长度(51-53nt)、tm值(68.8-70℃)、gc含量(52.8％-56.9％)和形成发卡结构的互补碱基数(10-11)差异较小，基本一致，与通用茎环引物的差异较大。四种不同茎环引物形成发卡结构的时δg(吉布斯自由能变)的大小均为负，且绝对值差异较小(13.3-15.6)，基本一致，而与通用茎环引物的δg(-20.4kcal/mol)差异较大，表明四种不同茎环引物的逆转录效率基本一致，保证了四种茎环引物在多重逆转录中的效率一致性，避免了逆转录效率不高造成的逆转录不充分。综上，不同茎环引物在结构和引物参数上差异较小，基本一致。茎环引物和检测引物、探针之间结构序列互不干扰，不同mirna的逆转录效率互不影响。

8、基于上述茎环引物设计的逆转录引物能够实现靶标mirna和内参在同一管中逆转录和检测，极大降低了靶标mirna和内参在两个或多个反应体系中逆转录和检测产生的误差。

9、不同茎环引物的多重逆转录和多重检测极大降低了mirna的检测时间和检测成本，即实现了mirna茎环法检测的经济便捷性。

10、第二方面，本发明提供了一种逆转录引物，其包括如下结构：5’-通用茎环引物-待测mirna的3’末端起数的6-8个碱基的反向互补序列。

11、例如：待测mirna的3’末端起数的6个、7个或8个碱基的反向互补序列。

12、在本发明应用较佳的实施方式中，逆转录引物包括如下结构：5’-通用茎环引物-待测mirna的3’末端起数的6个碱基的反向互补序列。

13、第三方面，本发明提供了用于mirna逆转录的试剂或试剂盒，其包括：上述的逆转录引物。

14、在本发明应用较佳的实施方式中，试剂或试剂盒还包括：反转录预混液、酶预混液和水。

15、反转录预混液(rt mix)包括：反转录反应所需的缓冲液、金属离子等。金属离子包括不限于mg离子。

16、酶预混液包括反转录酶，例如选自hiscript ii enzyme mix。

17、在本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒还包括：用于mirna扩增的pcr引物、探针、qpcr预混液、荧光染料和水。

18、用于mirna扩增的pcr正向引物可以根据mirna自身碱基组成及gc含量，从5’端选择13-16个特异序列即可(与常规qpcr引物设计原则一致，例如gc含量40％～60％，tm值56-65℃)。如若需要调整引物的tm值或延长荧光定量pcr产物的长度，可于5’端添加c/g碱基或通用序列。

19、用于mirna扩增的pcr反向引物：统一反向引物urp(unified reverse primer)为茎环部分反向互补序列，不同mirna反向引物可以通用也可另外设置。例如选自“cctgaaccctgaaccctga”、“actgcccgaccctacctg”或“cccgtcaagccagtcaagt”。

20、在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。

21、在本发明应用较佳的实施方式中，探针的5’端带有荧光报告基团，探针的3’端带有荧光淬灭基团。

22、荧光报告基团包括不限于hex、fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、cy3、cy5、texasred、ned、alexa flour或vic，淬灭基团包括不限于mgb、tamra、bhq1、bhq2、bhq3或qsy。

23、在其他实施方式中，本领域的技术人员也可在探针的内部也设置一个淬灭基团，以实现双淬灭，从而降低荧光背景信号低、减少不同通道间干扰。

24、第四方面，本发明还提供了通用茎环引物或逆转录引物在制备mirna检测试剂或试剂盒中的应用。

25、检测试剂的形态包括不限于冻干粉、液体、半固体。

26、在本发明应用较佳的实施方式中，试剂或试剂盒通过如下方法进行mirna的检测：

27、(i)采用逆转录引物对待测mirna样本进行逆转录反应；

28、逆转录反应的条件为：25℃，5min；50-55℃，15min；85℃，5min；

29、(ii)对逆转录反应后的产物进行荧光定量pcr反应，荧光定量pcr反应的条件为：95℃，5-10min；95℃，10s，60℃，34-40s，循环40-45次。

30、在其他实施方式中，本领域的技术人员可根据所采用的逆转录酶的活性自适应调整逆转录反应的条件。

31、在本发明应用较佳的实施方式中，逆转录反应的体系中，任意一种通用茎环引物或逆转录引物的终浓度为0.05-0.2μm。优选地，任意一种通用茎环引物或逆转录引物的终浓度为0.1μm。

32、在本发明应用较佳的实施方式中，荧光定量pcr反应的体系中，用于mirna扩增的任意一种pcr引物的终浓度为0.1-1.0μm，优选为0.2μm；探针的终浓度为0.05-0.25μm，优选为0.1μm。

33、在本发明应用较佳的实施方式中，待测mirna样本来源于细胞内、体液、培养液和灌洗液中的至少一种。灌洗液如肺泡灌洗液、胃镜检灌洗液等。

34、在本发明应用较佳的实施方式中，待测mirna样本来源于组织、细胞、血液、血液分离物、外泌体、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、泪液、羊水和汗液中的至少一种。

35、在本发明应用较佳的实施方式中，血液分离物包括不限于血清、血浆、血小板、红细胞和白细胞中的至少一种。

36、在本发明应用较佳的实施方式中，mirna选自如下至少一种：川崎病相关的mirna、肿瘤相关的mirna、畜禽致病菌的mirna、自身免疫疾病的mirna。

37、在本发明应用较佳的实施方式中，川崎病相关的mirna选自mir-182-5p、mir-183-5p和mir-941、mir-151a-3p、mir-186-5p、mir-199a-3p和mir-126-3p中的至少一种。

38、上述肿瘤相关的mirna，肿瘤的类型包括不限于：上皮性肿瘤和血液肿瘤。

39、上皮性肿瘤包括不限于乳头状瘤、胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、乳腺癌、腺瘤或鳞癌。

40、胃肠癌选自食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、小肠癌、结肠直肠癌和肛门癌。

41、在一种可选的实施方式中，腺癌包括不限于肺腺癌、甲状腺癌、涎腺癌或胰腺癌。

42、在一种可选的实施方式中，腺瘤包括不限于囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。

43、在一种可选的实施方式中，乳腺癌包括不限于乳腺上皮癌；

44、优选地，所述乳腺癌为乳腺导管癌或乳腺小叶癌。

45、乳腺癌，优选ii期至iv期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)。

46、卵巢癌，浆液性和粘液性癌(优选地ic期至iiib期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤。

47、子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地i期至iiic期)。

48、膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地ii期至iv期)。

49、肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地i期至iiib期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌。

50、鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌(例如食管鳞癌)、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。

51、口腔鳞状上皮细胞癌(oral squamous cell carcinoma，oscc)又称口腔鳞癌。口腔鳞癌例如包括不限于舌鳞癌。

52、在其他实施方式中，上述鳞癌也可以是支气管、膀胱、肾盂等部位通过鳞状上皮化生而形成的鳞状细胞癌。

53、血液肿瘤选自急性髓性白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、骨髓增生异常综合征(mds)和急性淋巴细胞白血病(all)中的任一项。

54、第五方面，本发明还提供了一种mirna的检测方法，方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：

55、(i)采用上述的逆转录引物对待测mirna样本进行逆转录反应；

56、逆转录反应的条件为：25℃，5min；50-55℃，15min；85℃，5min；

57、(ii)对逆转录反应后的产物进行荧光定量pcr反应，荧光定量pcr反应的条件为：95℃，5-10min；95℃，10s，60℃，34-40s，循环40-45次。

58、在本发明应用较佳的实施方式中，逆转录反应的体系中，任意一种通用茎环引物或逆转录引物的终浓度为0.05-0.2μm，优选为0.1μm；

59、在本发明应用较佳的实施方式中，荧光定量pcr反应的体系中，用于mirna扩增的任意一种pcr引物的终浓度为0.1-1.0μm，优选为0.2μm；探针的终浓度为0.05-0.25μm，优选为0.1μm。

60、本发明具有以下有益效果：

61、(1)本发明提供的通用茎环引物逆转录mirna的数量由1个提升至4个，结合不同荧光基团标记的taqman探针使得单个qpcr反应中可以检测多至4个mirna，即实现了mirna茎环法检测的多重逆转录和多重检测。

62、(2)不同茎环引物在结构和引物参数上差异较小，基本一致。茎环引物和检测引物、探针之间结构序列互不干扰，不同mirna的逆转录效率互不影响。

63、(3)基于上述茎环引物设计的逆转录引物能够实现靶标mirna和内参在同一管中逆转录和检测，极大降低了靶标mirna和内参在两个或多个反应体系中逆转录和检测产生的误差。

64、(4)不同茎环引物的多重逆转录和多重检测极大降低了mirna的检测时间和检测成本，即实现了mirna茎环法检测的经济便捷性。