一种3-脱氢莽草酸脱水酶突变体及产原儿茶酸的重组大肠杆菌

本发明属于生物，尤其涉及一种3-脱氢莽草酸脱水酶突变体及产原儿茶酸的重组大肠杆菌。

背景技术：

1、原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸，pca)是一个在植物中广泛存在的天然酚酸。研究表明，该化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒和抗肿瘤等生物学活性，也可作为材料单体用于合成高性能聚合物和食品包装材料，因此广泛应用于制药、保健食品、化妆品和新型材料行业。目前，pca的生产主要包括植物提取和化学合成。常见的pca生产方法是从植物中提取，但由于产量低(例如，从gordonia axillaris果实中提取10.81μg/g)，其工业生产受到限制。通过香草酸去甲基化的化学pca合成有几个缺点，例如使用环境污染物(盐酸)以及需要高温条件(250℃)。在这种情况下，微生物发酵生产pca代表了一种绿色、更有效、可持续的获得这种化合物的替代方案，因此越来越受到研究者的关注，具有广阔的市场前景。

2、大肠杆菌中的3-脱氢莽草酸生物合成从葡萄糖开始，通过中心碳代谢两种中间体磷酸烯醇式丙酮酸(pep)和赤藓糖-4-磷酸(e4p)通过3-脱氧-d-阿拉伯庚糖酸-7-磷酸合酶(dahp)，dhq合酶(arob)和dhq脱水酶(arod)转化为3-脱氢莽草酸。随后，3-脱氢莽草酸在异源3-脱氢莽草酸脱水酶的催化下生成原儿茶酸。迄今为止，国内外很多团队对包括大肠杆菌、谷氨棒状杆菌、恶臭假单胞菌在内的不同微生物宿主菌株进行改造用于生产pca。然而，复杂的发酵过程和低产量限制了原儿茶酸的工业化生产。大肠杆菌具有遗传工具多、遗传信息清晰、快速生长和碳吸收率高的特点，是生产原儿茶酸的理想宿主，但pca的产物抑制降低3-脱氢莽草酸酶活性和产物对细胞的毒性限制了大肠杆菌中原儿茶酸的高效生产。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种3-脱氢莽草酸脱水酶突变体及一种高效生物合成原儿茶酸的大肠杆菌重组菌株，基于突变位点的高通量筛选工作，得到一突变体以解除原儿茶酸对aparoz的产物抑制，对含该突变体的重组大肠杆菌进行代谢改造，最终获得了一株高产原儿茶酸的大肠杆菌，5l发酵罐补料分批产量达到37.02g/l。

2、本发明的第一个目的是提供一种3-脱氢莽草酸脱水酶突变体，该突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，通过出发序列的第363位精氨酸突变为丙氨酸得到。具体地，序列如下：

3、mnilrlttlalglmvsgiaaaqtyvvdryqddsnkgslrwaieqananpgeasdiliqavgkapyaiklnsalpeikapvkiigtqwdktgeyiaidgsnyikgegakacpganpeqygtnvrtmtlpglvlrdvnnvtlkgldihrfcigvlinrssnnliqhnrisnnyggagvmltgddgqgnptatttnnnkvldnifqdngdgleltrgaafnliannhfvstkanpepsqgieilwgndnavvgnkfenysdglqinwgkrnyiaynemtnnsigfnmtgdgnildsnkvhgnrigvairsekdanakitltknliwdngkdikrceaggscvpdqrlgaivfavpalehagfvgsagggvivdpskqqktctqpneqgcnaqpnqgikapkltankglvavevnglpnqryqveffsnqnaaskeaeqylgaitvatdaqgiakanwkpsvkvasitanitdrfgatselssalqtk。

4、本发明的第二个目的是提供编码上述3-脱氢莽草酸脱水酶突变体的核酸。

5、进一步地，核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明的第三个目的是提供携带上述核酸的载体。

7、本发明的第四个目的是提供表达上述3-脱氢莽草酸脱水酶突变体的细胞。

8、进一步地，所述细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

9、本发明的第五个目的是提供上述3-脱氢莽草酸脱水酶突变体、核酸、载体、细胞在制备含原儿茶酸的产品中的应用。

10、本发明的第六个目的是提供一种产原儿茶酸的重组大肠杆菌，以大肠杆菌为宿主改造得到，所述改造包括：过表达编码上述3-脱氢莽草酸脱水酶突变体的基因。

11、进一步地，采用强启动子pj23119控制3-脱氢莽草酸脱水酶基因的表达。

12、进一步地，连接促溶标签增强3-脱氢莽草酸脱水酶的可溶性表达，其中，促溶标签包括但不限于sumo(seq id no.2)，本发明的一个实施例中通过连接肽(ggggs)3将sumo与aparozr363a连接。

13、进一步地，所述改造还包括以下任一：敲除莽草酸激酶i编码基因arok、莽草酸激酶ii编码基因arol、磷酸转运蛋白编码基因ptsh、磷酸烯醇式丙酮酸蛋白磷酸转移酶编码基因ptsi、pep依赖二羟基丙酮激酶编码基因dhal和莽草酸脱氢酶编码基因aroe；利用生长偶联启动子prrnc动态调控丙酮酸激酶i编码基因pykf；并过表达了抗反馈抑制dahp合成酶编码基因arogfbr、3-脱氢奎尼酸脱水酶的编码基因arod、转醛醇酶编码基因talb、转酮醇酶编码基因tkta、丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glya、运动假单胞菌葡萄糖促进蛋白编码基因zmglf、葡萄糖激酶编码基因zmglk和莽草酸耐受基因prov。

14、进一步地，过表达arogfbr和arod基因是通过使用强启动子pj23119分别控制arogfbr、arod基因表达，过表达talb基因是通过采用强启动子pj23101控制talb表达，过表达tkta基因是通过采用强启动子pj23108控制tkta表达，过表达glya基因是通过采用强启动子ptac控制glya表达，过表达prov基因是通过采用压力响应启动子prpos调控莽草酸耐受基因prov表达。

15、进一步地，莽草酸激酶i编码基因arok的ncbi编号为yp_026215.2、莽草酸激酶ii编码基因arol的ncbi编号为np_414922.1、磷酸转运蛋白编码基因ptsh的ncbi编号为np_416910.1、磷酸烯醇式丙酮酸蛋白磷酸转移酶编码基因ptsi的ncbi编号为np_416911.1、pep依赖二羟基丙酮激酶编码基因dhal的ncbi编号为np_415717.1、莽草酸脱氢酶编码基因aroe的ncbi编号为np_417740.1。

16、进一步地，丙酮酸激酶i编码基因pykf的ncbi编号为np_416191.1、3-脱氢奎尼酸脱水酶的编码基因arod的ncbi编号为np_416208.1、转醛醇酶编码基因talb的ncbi编号为np_414549.1、转酮醇酶编码基因tkta的ncbi编号为yp_026188.1、丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glya的ncbi编号为np_417046.1、莽草酸耐受基因prov的ncbi编号为np_417163.1；dahp合成酶编码基因arogfbr的核苷酸序列如seq id no.4所示、运动假单胞菌葡萄糖促进蛋白编码基因zmglf的核苷酸序列如seq id no.5所示、葡萄糖激酶编码基因zmglk的核苷酸序列如seq id no.6所示。

17、进一步地，生长偶联启动子prrnc的核苷酸序列如seq id no.7所示，强启动子pj23119的核苷酸序列如seq id no.8所示，强启动子pj23101的核苷酸序列如seq id no.9所示，强启动子pj23108的核苷酸序列如seq id no.10所示，压力响应启动子prpos的核苷酸序列如seq id no.11所示。

18、本发明的第七个目的是提供上述重组大肠杆菌在制备含原儿茶酸的产品中的应用。

19、进一步地，所述的应用是采用所述的重组大肠杆菌在发酵培养基中进行发酵，得到含有原儿茶酸的发酵液。

20、进一步地，在所述的发酵过程中，初始培养基中葡萄糖耗尽时，流加500～800g/l葡萄糖，并控制葡萄糖浓度在5g/l以下。

21、进一步地，在所述的发酵过程中，ph控制在6.5～7.1，发酵温度控制在36～38℃，溶氧控制在10％-30％。

22、进一步地，所述的发酵培养基配方为：葡萄糖18～22g/l，酵母粉8～12g/l，蛋白胨4～6g/l，柠檬酸铁胺1.3～1.7g/l，磷酸氢二钾4～6g/l，七水硫酸镁0.8～1.2g/l，色氨酸0.08～0.12g/l，酪氨酸0.08～0.12g/l，苯丙氨酸0.08～0.12g/l，金属离子液0.8～1.2ml/l。

23、本发明的有益效果：

24、本发明通过对3-脱氢莽草酸脱水酶进行突变位点筛选，发现一个能够有效缓解产物原儿茶酸对aparoz的产物抑制的突变体，并基于该突变体构建了一株高产原儿茶酸的escherichia coli fmme-pca01，其中敲除了大肠杆菌中3-脱氢莽草酸脱氢酶基因aroe，并过表达了具有抵抗产物抑制的高活性3-脱氢莽草酸脱水酶突变体aparozr363a。所述重组大肠杆菌具有较好地遗传稳定性，连续传代12代，也可以稳定生产大约37.02g/l的原儿茶酸，本发明发酵生产原儿茶酸的工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。