一种提高通用型CAR-T细胞产量和活性的制备方法与流程

本发明涉及生物医药，具体涉及一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)疗法在抗肿瘤治疗中取得了巨大成功，尤其是针对血液系统恶性肿瘤。尽管如此，自体car-t细胞治疗中的一些限制因素导致其无法大规模用于临床应用，例如昂贵且漫长的生产过程和有限的细胞来源。

2、为了克服这些缺点，同种异体通用型car-t细胞随之诞生。现有的通用型car-t细胞通过将一型人白细胞抗原(humanleucocyteantigen，hla)和t细胞受体(tcellreceptor，tcr)进行敲除，可以降低细胞免疫原性，同时避免同种异体细胞对宿主的攻击，为更多患者通过car-t疗法进行有效治疗提供支持。

3、tcr是一种存在于t细胞表面的复杂蛋白质，tcr由两个链组成，称为α链和β链，每个链都具有可变(v)区域和恒定(c)区域。可变区域负责特异性识别抗原肽，而恒定区域则连接细胞膜并传递信号。由于随机重组机制，可变区域可以产生极高的多样性，从而使t细胞能够识别出大量不同的抗原肽。

4、tcr不仅具有识别细胞抗原的功能，tcr激活可促进许多信号转导级联反应，通过调控细胞因子产物、细胞生存、增殖和分化来最终决定细胞命运。敲除tcr将导致细胞增殖受到很大影响。

5、表达一型主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)的异体细胞可被宿主cd8+t细胞(killertcell)识别并消灭。hla-i基因(hla-a,hla-b,hla-c)编码mhc-ⅰ，敲除hla-i类分子，有助于同种异体t细胞更好地在宿主体内存活。

6、t细胞表面由hla-dr、hla-dp、hla-dq、hla-dm、hla-do组成的hla-ii类分子是cd4+t辅助细胞识别的重要靶点，同样是宿主细胞识别异体细胞的一类靶点。hladra是hlaⅱ类α链旁系同源物之一。通过敲除hla-dra，可以进一步降低移植细胞的免疫原性，有效的降低宿主抗移植物反应以及免疫排斥风险。

7、crispr/cas9系统是基因编辑工具家族的最新成员，通过与sgrna组合，crispr/cas9系统可以方便地对多个基因位点同时进行编辑，目前已广泛应用于多类car-t细胞基因编辑场景。

8、但频繁的基因敲除对细胞的生长与增殖同样会造成伤害，因此本发明致力于提供一种适宜通用型car-t细胞生长和增殖的制备方法，最大限度地提高通用型car-t细胞的产量和质量。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，用于提升通用型car-t细胞的产量和活性，以利于细胞增殖并且适用于临床研究。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，包括以下步骤：

3、1)、细胞过夜培养；

4、2)、倾倒培养基后加入无血清dmem培养基以及转染体系，培养6h；

5、3)、24h之后，过滤进行敲除，继续培养；

6、4)、取出后进行分选，放入t75培养瓶中继续培养，制预定天数之后，获取通用型car-t细胞。

7、作为优选的，所述细胞为t细胞和/或car-t和/或通用型car-t细胞。

8、更为优选的，所述细胞为t细胞。

9、作为优选的，所述分选利用cd3/cd28激活磁珠或用cd3阳选磁珠进行。

10、更为优选的，所述分选利用cd3阳选磁珠进行。

11、作为优选的，所述分选位于第3天或第12天进行。

12、更为优选的，所述分选第12天进行。

13、作为优选的，所述细胞在分选第2-6天进行敲除。

14、更为优选的，所述细胞在分选第4天进行敲除。

15、作为优选的，敲除所述t细胞的tcr和hla-i类分子或敲除t细胞的tcr和hla-ii类分子或敲除t细胞的tcr，hla-i类分子和hla-ii类分子。

16、更为优选的，敲除所述t细胞的tcr，hla-i类分子和hla-ii类分子。

17、在上述技术方案中，本发明提供的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，具备以下有益效果：本发明从多角度实验分析确定了最适宜通用型car-t细胞的制备方法，可以得到活性高、敲除效率高的高纯度cd3-car-t细胞，是现有car-t细胞生产所没有的，为通用型car-t细胞的工业生产奠定基础。

技术特征：

1.一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述细胞为t细胞和/或car-t和/或通用型car-t细胞。

3.根据权利要求1所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述细胞为t细胞。

4.根据权利要求1所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述分选利用cd3/cd28激活磁珠或用cd3阳选磁珠进行。

5.根据权利要求4所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述分选位于第3天或第12天进行。

6.根据权利要求5所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述分选第12天进行。

7.根据权利要求1所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述细胞在分选第2-6天进行敲除。

8.根据权利要求7所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，所述细胞在分选第4天进行敲除。

9.根据权利要求7或8任一项所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，其特征在于，敲除所述t细胞的tcr和hla-i类分子或敲除t细胞的tcr和hla-ii类分子或敲除t细胞的tcr，hla-i类分子和hla-ii类分子。

10.根据权利要求9所述的一种提高通用型car-t细胞产量和活性的制备方法，敲除所述t细胞的tcr，hla-i类分子和hla-ii类分子。

技术总结
本发明公开了一种提高通用型CAR‑T细胞产量和活性的制备方法，包括以下步骤：1)、细胞过夜培养；2)、倾倒培养基后加入无血清DMEM培养基以及转染体系，培养6h；3)、24h之后，过滤进行敲除，继续培养；4)、取出后进行分选，放入T75培养瓶中继续培养，制预定天数之后，获取通用型CAR‑T细胞。该发明提供的提高通用型CAR‑T细胞产量和活性的制备方法，在分选第四天敲除CAR‑T细胞的TCR、HLA‑I、HLA‑II类分子，并在第12天使用CD3microbeads过吸附柱分选可以得到最大的敲除效率，得到活性高、敲除效率高的高纯度CD3‑CAR‑T细胞。

技术研发人员：张照,陈正亮,黄庭晖
受保护的技术使用者：南京康和细胞基因工程研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24