一种胰淀素及其类似物重组制备方法及其应用与流程

本发明涉及多肽重组制备领域，具体包括重组人胰淀素及其类似物的重组表达制备的方法和应用。

背景技术：

0、发明背景

1、胰淀素(amylin)又称为胰淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide，iapp)，是一种胰腺β细胞的重要激素，它与胰岛β细胞的胰岛素共定位、共包装和共同分泌，是37个氨基酸的多肽。

2、生理上，胰淀素通过迷走神经作用于胰腺，抑制胰高血糖素分泌，有效降低餐后血糖。此外，胰淀素与大脑神经元细胞膜上胰淀素受体相结合，通过受体介导信号转导作用于下丘脑摄食中枢，产生饱食效应，有利于控制体重。胰淀素还作用于脑干后部迷走神经丛，再通过迷走神经信号转导作用于胃，延缓胃排空的作用使小肠吸收葡萄糖速度变慢，吸收入血时间延长，进而降低餐后血糖。

3、人胰淀素最初在细胞内合成89氨基酸前多肽，分泌后被切除信号肽处理为67个氨基酸的前体iapp(proiapp)，再通过加工得到37个氨基酸的胰淀素成熟蛋白。若人体内加工产生成熟胰淀素的酶系统病变，会导致胰淀素无法被加工成熟而诱发糖尿病。

4、天然人胰淀素因其一级结构不稳定，易聚集产生不可溶状态的有细胞毒性的纤维状沉淀，引发β细胞凋亡，减弱血糖调节能力，从而诱发糖尿病。经过改造后的胰淀素类似物普兰林肽(pramlintide)(商品名：symkin，amylin公司)，增强了其稳定性，延长了其半衰期，每日皮下注射给药3次，用于治疗糖尿病。

5、诺和诺德公司(novo nordisk)在普兰林肽的基础上进一步改造得到的胰淀素类似物卡格列肽(cagrilintide)，极大的提高了体内外的稳定性，体内半衰期从1h延长至170h。临床证明可以协调glp1药物用于降低血糖以及体重管理，胰淀素类似物cagrilintide与semaglutide联合应用，每周一次，皮下注射，32周体重减少15.6％。此外，eli lilly、zealand pharma、amylin pharmaceutical已将胰淀素类似物以减肥适应症推进临床，展现了胰淀素类似物在减肥适应症中具有极大的开发价值。

6、已上市的普兰林肽(pramlintide)保留了天然胰淀素羧基末端酰胺化修饰以发挥其生物活性，并且是以化学合成法生产。目前公开报道的胰淀素及其类似物以化学合成为主，重组制备方法较少，例如专利《cn 106554405 b》公开了一种化学合成法制备胰淀素类似物。

7、基于胰淀素在临床上的重要价值，目前化学合成法生产胰淀素类似物，存在收率低、纯度低、成本高和环境污染问题。本发明提供一种基因工程重组技术，高效重组表达制备胰淀素或胰淀素类似物的方法。

技术实现思路

1、本发明提供一种高效重组表达胰淀素及其类似物融合蛋白的方法。

2、本发明的第一个目的，是提供一种促表达序列，促表达序列人转录因子(humantranscription factor,taf,氨基酸序列见seq3)，该促表达序列可以显著增加胰淀素及其类似物的产量。本发明研究发现，在不含该taf的情况下，胰淀素及其类似物表达量极低，而添加促表达序列taf的融合蛋白，能显著提高融合蛋白产量，融合蛋白经过合适的条件进行捕获，酶切，回收得到大量胰淀素及其类似物，具有产业化意义。

3、通过突变一个或多个氨基酸，与taf同源性在80％以上的其他促表达序列是本领域常见手段。

4、第二个目的，本专利发明了一种高效重组表达的融合蛋白，以及一种可以制备胰淀素及其类似物的方法。

5、在一些实施例中，所述的胰淀素及其类似物的氨基酸序列如seq1和seq2。

6、在一些实施例中，融合蛋白包含促表达序列taf、胰淀素类似物、以及用于连接taf和胰淀素类似物的linker，所述的linker含有特异性酶切位点。

7、在一些实例中，linker可以被肠激酶特异性识别切割，linker的氨基酸序列为：ddddk或者dgegr。

8、在一些实施例中，所述的融合蛋白的氨基酸序列为seq6～seq9，将融合蛋白的基因，用nde i和bamh i酶切位点插入载体pet-30a分别构建重组质粒，转染宿主菌bl21(de3)，使用50μg/ml的卡那霉素抗性平板筛选得到工程菌。工程菌经过发酵培养诱导表达后，收集菌体，每1kg菌体使用10l 50～100mm tris ph8.0重悬，600bar～700bar压力条件下，破菌次数为5～8次，7000rpm离心5～10分钟收集沉淀。

9、在一些实施例中，每1g沉淀使用10ml 50mmol/l tris 2mol/l尿素ph8.0溶解后，补入不低于0.3mg肠激酶37℃，室温反应16h。反应后样品经过过滤，使用离子交换层析、反相层析得到胰淀素类似物。

10、在一些实例中，促表达序列taf的c端和胰淀素类似物序列的n端直接连接，不含linker，其中所述的胰淀素类似物氨基酸序列的n端为赖氨酸。

11、在一些实施例中，本发明巧妙的利用蛋白酶lys-n，可以特异性切割胰淀素及其类似物的氨基酸序列末端赖氨酸(lys，k)的氨基端，因此将胰淀素类似物进行首尾串联时，仅通过蛋白酶lys-n切割可以得到完整的胰淀素类似物，不需要额外添加linker。

12、在一些实施例中，所述的融合蛋白的氨基酸序列为seq11-seq14、seq16-19，将融合蛋白的基因，用nde i和bamh i酶切位点插入载体pet-30a构建重组质粒，转染宿主菌bl21(de3)，使用50μg/ml的卡那霉素抗性平板筛选得到工程菌。工程菌经过发酵培养诱导表达后，收集菌体，每1kg菌体使用10l 50～100mm tris ph8.0重悬，600bar～700bar压力破菌5～8次，7000rpm离心5～10分钟收集沉淀。

13、在一些实施例中，每1g沉淀使用10ml 50mmol/l tris 2mol/l尿素ph8.0溶解后，补入不低于0.1mg蛋白酶lys-n，37℃，室温反应16h。反应后样品经过过滤，使用离子交换层析、反相层析得到胰淀素类似物。

14、本发明的第三个目的，提供了一种编码融合蛋白的重组工程菌。

15、在一些实施例中，所述重组工程菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。

16、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌jm109(de3)、大肠杆菌hms174(de3)、大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌rostta2(de3)、大肠杆菌rosttagami(de3)、大肠杆菌rostta2(de3)、大肠杆菌dh5α、大肠杆菌w3110和大肠杆菌k12之一。

17、在一种实施方式中，将所述重组工程菌按1％(v/v)比例接种至100ml lb培养基，在32～37℃下培养16～24h，得到种子液，然后按照1％～5％(v/v)的接种量接入lb培养基中培养至发酵液od600值达到10～20时，加入终浓度为0.05～1mm的iptg进行诱导，在25～35℃下诱导12～24h后结束发酵，将发酵后的菌体破碎，包涵体溶解，酶切，离子层析，得到胰淀素或其类似物。

18、在一些实施例中，上述制备的胰淀素及其类似物经一定化学处理评估其体外活性，通过受试肽激活hct-r或hamyr3后，诱导camp的形成，并使用来自perkin-elmer的camp测定试剂盒(cat.no.6760635r)对其进行测量，结果显示胰淀素及其类似物ec50均小于0.5nm，具体检测方法参考专利cn109863168a。

19、本发明的第四个目的，提供一种酰化胰淀素类似物的方法。

20、一种赖氨酸ε侧链脂肪酸修饰的步骤在于：将胰淀素类似物amy，溶解于20～400mmna2co3缓冲中，加入50％(v/v)体积的乙腈，1mol/l naoh调节ph10.0～11.0，胰淀素类似物浓度1mg-100mg/ml。

21、修试剂c20-glu-osu按2～400mg/ml浓度溶解于二甲基甲酰胺(dmf)。按胰淀素类似物：活化修试剂摩尔比＝1:1～2，将两者混匀，25～37℃搅拌反应0.5～2h，体系中加入5倍体积的冰水，2～8℃搅拌0.5h，离心得到酰化胰淀素类似沉淀物；沉淀物按1g溶解于10～50ml三氟乙酸(tfa)中，搅拌0.5～2h，加入5倍体积的纯化水，2～8℃搅拌0.5～2h，离心得到沉淀物，沉淀物按1g溶解于10～50ml 0.1～1％冰醋酸缓冲液，经反相层析捕获，干燥得到酰化胰淀素类似物，c20-glu-ε-amy。

22、一种赖氨酸α侧链位点脂肪酸修饰的步骤在于：将胰淀素类似物amy，溶解于20～400mm na2co3缓冲中，加入50％(v/v)体积的乙腈，1mol/l naoh调节ph8.0～9.0，胰淀素类似物浓度1mg-100mg/ml。

23、修试剂c20-glu-osu按2～400mg/ml浓度溶解于二甲基甲酰胺(dmf)中。按胰淀素类似物：修试剂摩尔比＝1:1～2，将两者混匀，25～37℃搅拌反应0.5～2h，体系中加入5倍体积的冰水，2～8℃搅拌0.5h，离心得到酰化胰淀素类似沉淀物；沉淀物按1g溶解于10～50ml三氟乙酸(tfa)中，搅拌0.5～2h，加入5倍体积的纯化水，2～8℃搅拌0.5～2h，离心得到沉淀物，沉淀物按1g溶解于10～50ml 0.1～1％冰醋酸缓冲液，经反相层析捕获，干燥得到酰化胰淀素类似物，c20-γglu-α-amy。