一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌及筛选方法和应用

本发明属于农业微生物应用，更具体涉及一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌，同时还涉及一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌的筛选方法，还涉及一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌在家禽养殖中的应用。

背景技术：

1、我国是畜禽养殖大国，由于饲用抗生素的应用，引起了病原微生物产生耐药性、畜禽自身免疫能力降低以及药物残留等一系列问题[阮忱.2018.益生菌对无量山乌骨鸡雏鸡生产性能和肠道菌群的动态影响[d/ol].昆明理工大学,2023.]。为解决这些问题，研究者们挖掘了益生菌作为抗生素的替代品，主要用于提升动物生产性能和促进动物机体健康[李修宇.2021.日粮中添加益生菌对灵山土鸡生长性能、血液指标、肠道形态和盲肠菌群的影响[d/ol].广西大学,2023.]。有研究表明，鸡日粮中添加枯草芽胞杆菌制剂，可显著提高空肠消化酶活性，增强肠道的消化功能，促进盲肠中短链脂肪酸的产生以及免疫器官的发育[朱沛霁.枯草芽孢杆菌对雪山鸡生产性能、肠道健康和免疫机能的影响及机制[d].扬州大学,2017.]。

2、在肉鸡规模化养殖中，饲喂肉鸡所用的饲料营养物质含量丰富，其中蛋白质占比能达到20％以上；而鸡的消化道与其它的农场动物(猪、牛、羊)相比较短，消化道容积较小，导致营养物质的消化不够充分，饲料利用率较低。有研究表明，在饲料中添加一定量的消化酶(蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等)，能提高饲料利用率，其中添加蛋白酶还能改善鸡肉肉质[方立超,宋代军,阚宁等.饲粮能量和蛋白质水平对肉鸡肉质的影响[j].西南农业学报][李东东,李宗锐,丁雪梅等.不同粗蛋白质水平饲粮添加外源蛋白酶对肉鸡生产性能、血清生化指标和抗氧化功能的影响[j].动物营养学报,2015.]。

3、鸵鸟是世界上体型最大的一种鸟类，有生长快和抗病力强等优点，此外鸵鸟肉还具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇、低热量等特点[韩占兵,胡肖扬&张立恒.(2018).鸵鸟的经济价值与养殖效益分析]。动物机体的生长发育及抗病力不仅受自身基因控制，还与肠道内大量存在的微生物紧密相关[francisco guarner；juan-r malagelada.gut flora inhealth and disease[j].the lancet,2003(9356)]。因此，我们有理由相信鸵鸟生长快、抗病力强、肉质好等优点，不仅取决于鸵鸟的基因，还受其肠道菌群的调控。

4、本研究受现代动物微生态学关于肠道微生物是动物的第二套基因组理论启发，将鸵鸟的大体型、抗病力强、肉质好的特点与其肠道微生物的消化酶之间联系起来，聚焦解决肉鸡饲料中含量较多的蛋白质未能被充分消化吸收等问题，创造性地选择从鸵鸟的肠道中，以消化酶的活力为标准来筛选有益微生物，通过抑菌实验、耐酸耐胆盐耐高温的抗逆性实验以及对菌株耐药性和毒力基因的检测，筛选出了一株具有产蛋白酶性能、抗逆性较好且安全有效的益生菌株。又通过饲喂肉鸡试验证实，该菌株具有助消化促生长的作用，达到了本发明的目的。本发明方法易行，操作简单且实用高效，但本发明株对高温的耐受力相对较差，具体如何投入到生产实际中还有待我们进一步研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是在于提供了一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌，该芽胞杆菌产蛋白酶和纤维素酶，能够提升肉鸡消化蛋白酶和纤维素酶的能力。此外该芽胞杆菌的耐酸能力相对较强，芽胞体在ph3.0处理2h，存活率为72.56％，因此可以耐受肉鸡肠道内的胃酸，有利于菌株在肠道内的定植。

2、本发明的另一个目的是在于提供了促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌的筛选方法，方法易行，操作简便，该分离菌株安全、高效且环保。通过产酶试验、抑菌实验、耐酸耐胆盐耐高温的抗逆性实验以及对菌株耐药性和毒力基因的检测，用最适用的方法筛选出了一株具有产蛋白酶性能、抗逆性较好且安全有效的益生菌株。

3、本发明还有一个目的是在于提供了一株沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6在畜禽饲用微生态添加剂中的应用，应用于肉鸡养殖业中并提高了其生产效益。

4、为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

5、一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌的筛选方法，其步骤是：

6、a、样品取自湖北省武汉市九峰山森林动物园中鸵鸟的粪便，于冰盒中带回实验室处理。

7、b、取1g鸵鸟粪便加入9ml无菌生理盐水，适当摇晃瓶身使其混合均匀；

8、c、进行10-1～10-4梯度稀释(100μl培养液加入900μl灭菌水中进行梯度稀释)；

9、d、取10-2、10-3、10-4三个稀释度培养液涂布于添加了2.5％脱脂乳粉的lb培养基中，平板置于37℃培养箱培养23－25h，挑取菌落周围产透明圈的单菌落进行纯化培养。

10、e、对纯化菌株进行革兰氏染色，获得革兰染色呈阳性，短杆状，单个、成双或链状排列(见图2)。

11、本发明以产酶性能为标准，从鸵鸟的粪便中，分离筛选得到一株产蛋白酶和纤维素酶能力均较强的菌株，发明人经过鉴定，所得菌株为沙福芽胞杆菌，发明人将其命名为沙福芽胞杆菌o-6(bacillus safensis o-6)，于2023年08月31日送到中国.武汉.武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctcc no：m 20231572。

12、沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6的菌学特性：

13、沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6在lb培养基上长成圆形、表面光滑、边缘整齐、直径2mm左右的菌落(见图1)。该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈单个直杆状、两端钝圆、有芽胞(见图2)。克隆其16s rrna基因并进行测序，在ncbi进行blast对比，发现本发明菌株的16s rrna序列与沙福芽胞杆菌(hq699512.1)的同源性最高，为99.86％。

14、沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6的繁殖能力较强，0-1h处于迟缓期，1-27h后进入对数生长期，27h～33h菌体量趋于稳定，到33h～41h内菌体量又迅速增加，41h后生长速率逐渐降低进入到平稳期。菌液ph为6.33。沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6产芽胞，芽胞体在ph3.0的lb培养基中孵育2h，存活率为72.65％；在0.3％的胆盐中孵育2h，存活率为0％，孢子状态下较耐酸，不耐胆盐。

15、沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6在含有2.5％脱脂奶粉的乳白色lb平板上生长，菌落周围形成透明圈，说明该菌株产蛋白酶(见图3)。该菌株在以羧甲基纤维素钠(cmc-na)为唯一碳源的平板上长出的菌落，经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图4)，说明该菌株能够外分泌纤维素酶从而水解纤维素。

16、沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6对金黄色葡萄球菌atcc25923、沙门氏菌c78-1、大肠杆菌k88在体外无明显的抑菌活性(见图5)。对常用兽用抗生素如青霉素、苯唑西林、氨苄西林、氧氟沙星、诺氟沙星、头孢曲松、多西环素、四环素、红霉素、庆大霉素、链霉素、阿米卡星均为高度敏感，证明其不存在散布耐药基因的风险。

17、一株促进肉鸡生长的鸵鸟源沙福芽胞杆菌在畜禽饲用微生态添加剂中的应用，其步骤是：

18、a、制备种子液：将菌株平板画线，37℃培养24h。挑取分离菌株于3ml的lb液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养12h后作为种子液。

19、b、制备发酵液：将种子液以1％的接种量接种到3ml的lb液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养12h作为发酵液，活菌数为4.74×107cfu/ml。

20、c、将发酵液以1ml/(只·天)的量加入到仔鸡的日常饮水中，自由饮用。该种方法能减少灌胃式给仔鸡带来的应激反应。

21、申请人将本发明菌株通过饮水饲喂的方式，进行了肉鸡饲养试验，发现其对肉鸡有显著促生长作用。

22、从大体型鸟类鸵鸟的粪便中分离筛选一株产酶(尤其是产蛋白酶)能力强的菌株，应用于肉鸡养殖业以提高其生产效益，该分离菌株安全、高效且环保。经16s rrna鉴定，本发明分离得到的益生菌株为沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)，并对该分离株的产酶性能(蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等)、安全性、抗逆性以及作为饲料添加剂对肉鸡促生长的效果进行了研究。

23、本发明从健康鸵鸟的新鲜粪便中筛选得到一株对肉鸡有显著促生长作用的沙福芽胞杆菌(bacillus safensis)o-6(兼备产蛋白酶和纤维素酶的能力)，经益生性能检测、抗逆性能检测、安全性评价、肉鸡饲喂等实验，表明该菌株可以作为促生长微生态饲料添加剂应用于肉鸡养殖。

24、本发明与现有技术相比，具有以下效果和优点：

25、(1)是从大体型鸟类-鸵鸟的粪便中分离得到的，产纤维素酶和蛋白酶能力强的菌株。

26、(2)本发明菌株产芽胞，稳定性强；在ph3.0处理2h，存活率为72.65％，有利于制备成微生态制剂及作为饲料添加剂应用于生产。

27、(3)动物试验证明，本发明菌株对肉雏鸡具有显著促生长作用，达到了本发明最终目的。

28、更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。