一种亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒和检测方法与流程

本发明属于临床检测产品，具体涉及一种开瓶稳定性好、抗肝素干扰能力强的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒和亮氨酸氨基肽酶检测方法。

背景技术：

1、亮氨酸氨基肽酶(lap)广泛分布于动物和植物组织中，其主要生物学作用是水解肽链n端由亮氨酸和其他氨基酸所形成的肽键，也能水解亮氨酸与氨形成的酰胺键(即亮氨酰胺)或亮氨酸与胺形成的肽键，但对亮氨酸与苯或萘的胺类所形成的肽键无作用，lap的分子量为75-80kda。另一种与lap性质、功能相似的氨基肽酶叫亮氨酸芳香基酰胺酶(leucine arylamidash,laa)，能水解一些氨基酸与芳香族胺(如含苯环的苯胺、萘胺等)所形成的酰胺类化合物，也水解亮氨酸对硝基苯胺和l-亮氨酰胺，其分子量为52kda。此外，来自胎盘的胱氨酸氨基肽酶(cystine aminopeptidase,cap)或称为胎盘亮氨酸氨基肽酶(placental leucine aminopeptidase,p-lap)，对lap及laa的底物也都具有水解作用。目前临床上的检测手段难以将以上三种酶截然分开，故将以上三种酶合称为lap。

2、lap广泛分布于肝、胰、胆、肾、小肠以及子宫肌层等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新，是反映肝、胆、胰等组织病变的酶。目前lap的检测方法主要有比色法、速率法、酶法、连续监测法和l-亮氨酰-p-硝基苯胺底物法等。利用l-亮氨酰-p-硝基苯胺底物法检测人体血清中亮氨酸氨基肽酶的活性，主要用于监测和诊断急慢性肝炎、淤胆型肝炎和肝硬化疾病，该方法具有检测仪器自动化、操作方便、检测结果可靠、高灵敏度、检测成本低等特点。

3、然而，目前市场上亮氨酸氨基肽酶的测定试剂盒具有以下缺陷：

4、1)通常采用l-亮氨酸-p-硝基苯胺(又称为l-亮氨酸对硝基苯胺或l-亮氨酸-4-硝基苯胺)这个底物，但目前运用这个底物l-亮氨酸-p-硝基苯胺，疏水参数计算参考值(xlogp)为1.7，极微溶解(0.24g/l,25℃)，此溶解度的底物满足不了试剂高分析灵敏度要求；配制的试剂因为l-亮氨酸-p-硝基苯胺在纯化水中溶解度不高，且会随着温度变化，溶解程度会发生明显改变而析出，这样导致试剂普遍存在着稳定性欠佳、重复性低等缺点。

5、2)一般只能测试血清样本，测试肝素钠和肝素锂抗凝剂的血浆标本容易出现干扰，导致测值不准确；而且，市面上有些试剂在刚开盖的情况下测试肝素钠和肝素锂血浆标本的测值较为正常，但是试剂放置2-8℃试剂仓内开盖两周后，试剂测试肝素血浆标本在生化仪上的测试结果出现明显升高的问题，即试剂开瓶稳定性测试的准确度受到影响。

技术实现思路

1、针对现有技术中底物亮氨酸氨基肽酶溶解度低和试剂开瓶稳定性差的问题，本发明开发了一种稳定性好、重复性好、抗干扰能力强的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒和检测方法。

2、本发明的技术方案具体如下：

3、本发明第一方面提供了一种稳定抗肝素干扰的氨基肽酶检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，r1试剂包括r1缓冲液、无机盐、酶促进剂、表面活性剂和防腐剂，r2试剂包括r2缓冲液、辅助溶剂、助溶剂、l-亮氨酸-p-硝基苯胺和防腐剂，其中助溶剂为甲醇或二甲亚砜，辅助溶剂为甘油、乙二醇、聚乙二醇(peg)中的一种或多种。

4、在本发明的试剂盒中，r2试剂利用辅助溶剂和助溶剂的协同作用有效增加了底物(即l-亮氨酸-p-硝基苯胺)在试剂中的稳定性和溶解度，避免了因底物溶解度低导致的r2试剂中底物用量少和易析出的问题，从而改善了现有氨基肽酶检测试剂稳定性差和重复性低的现象。

5、优选地，在上述检测试剂盒中，r1试剂包括50-200mmol/l r1缓冲液、100-500mmol/l无机盐、2-100g/l酶促进剂、5-30g/l表面活性剂和防腐剂，其ph为8.0～8.5；

6、r2试剂包括50-300mmol/l r2缓冲液、10-100g/l辅助溶剂、40-70g/l助溶剂、10-60mmol/ll-亮氨酸-p-硝基苯胺和防腐剂，其ph为3.0～5.5；辅助溶剂为甘油、乙二醇、peg6000、peg8000和peg20000中的一种或多种。

7、更优选地，在上述检测试剂盒中，防腐剂为proclin300，且proclin300在r1试剂中的浓度为2-5ml/l，在r2试剂中的浓度为0.5-5ml/l。

8、更优选地，在上述检测试剂盒中，r1缓冲液为tapso、tris、dipso、taps和hepes中的一种。

9、更优选地，在上述检测试剂盒中，无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸锌、氯化锌、硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、硫酸镁中的一种。

10、更优选地，在上述检测试剂盒中，所述酶促进剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇和胎牛血清中的一种或多种。

11、更优选地，在上述检测试剂盒中，所述表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚、聚氧乙烯(80)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温80)、emulgen a90、triton-100、genapolx-080、花王709和十二烷基甜菜碱(bs-12)中的一种。

12、更为优选地，在上述检测试剂盒中，所述r2缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸中的一种。

13、基于本发明提供的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，本发明第二方面提供了一种亮氨酸氨基肽酶检测方法，具体包括以下步骤：将待测样本与r1试剂混匀，孵育后再加入r2试剂混匀，孵育后测定吸光度。

14、优选地，在上述方法中，所述待测样本为血清样本或肝素抗凝血浆样本。

15、在本发明一具体实施例中，待测样本与r1试剂和r2试剂的体积比为1:16:4。

16、在本发明检测试剂盒和检测方法中，其基本检测原理为：待测样本中的亮氨酸氨基肽酶催化水解底物l-亮氨酰-p-硝基苯胺，生成亮氨酸和对硝基苯胺，对硝基苯胺在405nm处吸光度升高，通过测定吸光度升高的速率即可计算出样本中亮氨酸氨基肽酶的活性。

17、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

18、(1)针对底物l-亮氨酸-p-硝基苯胺基本不溶解于水的问题，本发明通过特定助溶剂和辅助溶剂的协同作用进行了解决，从而使得试剂的稳定性和重复性得到显著改善，大大提高试剂的稳定性、抗干扰能力以及灵敏度。

19、(2)本发明中的无机盐、酶促进剂、表面活性剂有且只能存在于r1试剂中，本发明利用无机盐、酶促进剂和表面活性剂协同作用，有助于消除肝素抗凝剂对酶促反应的干扰，从而实现肝素抗凝剂血浆样本的检测。

20、(3)本发明开发的检测试剂盒不仅具有良好的分析灵敏度，还具有优异的开瓶稳定性，实验数据表明，在开瓶一个月后抗干扰能力依旧很强，测值波动不明显，故该试剂盒具有不错的临床检测应用价值。

技术特征：

1.一种稳定抗肝素干扰的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包括r1缓冲液、无机盐、酶促进剂、表面活性剂和防腐剂，所述r2试剂包括r2缓冲液、辅助溶剂、助溶剂、l-亮氨酸-p-硝基苯胺和防腐剂，其中所述助溶剂为甲醇或二甲亚砜，所述辅助溶剂为甘油、乙二醇、peg中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，

3.根据权利要求2所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，所述r1缓冲液为tapso、tris、dipso、taps和hepes中的一种，所述r2缓冲液为乙酸–乙酸钠缓冲液、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液和磷酸氢二钠–柠檬酸中的一种。

4.根据权利要求2所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠、氯化钾、硫酸锌、氯化锌、硫酸钾、硫酸钠、氯化镁、硫酸镁中的一种或多种。

5.根据权利要求2所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，所述酶促进剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇和胎牛血清中的一种或多种。

6.根据权利要求2所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚、吐温80、emulgen a90、triton-100、genapolx-080、花王709和bs-12中的一种。

7.根据权利要求2所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为proclin300，所述proclin300在r1试剂中的浓度为2-5ml/l，在r2试剂中的浓度为0.5-5ml/l。

8.一种亮氨酸氨基肽酶检测方法，其特征在于，使用权利要求1～7任一项所述的亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒进行检测，具体为：将待测样本与r1试剂混匀，孵育后再加入r2试剂混匀，孵育后测定吸光度。

9.根据权利要求8所述的亮氨酸氨基肽酶检测方法，其特征在于，所述待测样本与r1试剂和r2试剂的体积比为1:16:4。

10.根据权利要求8所述的亮氨酸氨基肽酶检测方法，其特征在于，所述待测样本为血清样本或肝素抗凝血浆样本。

技术总结
本发明公开了一种亮氨酸氨基肽酶检测试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R1试剂包括缓冲液、无机盐、酶促进剂、表面活性剂和防腐剂，R2试剂包括缓冲液、辅助溶剂、助溶剂、底物和防腐剂，其中助溶剂为甲醇或二甲亚砜，辅助溶剂为甘油、乙二醇、PEG中的一种或多种；本发明利用助溶剂和辅助溶剂提高了底物在试剂中的稳定性，并通过添加抗干扰物质消除了肝素抗凝剂对酶促反应的干扰，从而大大改善了亮氨酸氨基肽酶试剂盒的性能。

技术研发人员：龚婷,华权高,彭彬,尚莹,梁艳,赵畅
受保护的技术使用者：武汉生之源生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24