具有高活性和耐受性的中性蛋白酶及其编码的基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别是指一种具有高活性和耐受性的中性蛋白酶及其编码的基因和应用。

背景技术：

1、

2、酶制剂作为绿色环保的催化剂，在工业生产中使用既能满足法规要求，又能满足客户对清洁技术和清洁、可持续生产方法的需求，从而降低对环境的影响。但大多数天然酶制剂对温度和ph敏感，易受外界环境影响而失活，无法满足工业生产需要。因此，筛选具有高活性和耐受性的酶资源成为酶在工业推广中的关键。

3、昆虫是地球上数量最大、种类最多、分布最广的生物类群，是尚未被充分开发与利用的巨大生物资源。昆虫肠道组织蕴含的丰富微生物资源，可作为有益微生物资源开发利用。公开号为cn117070394a的专利文献中公开了一株产碱性蛋白酶的嗜碱性菌株及其应用，该菌株为从美洲大蠊肠道中分离获得的碱卤芽孢杆菌属细菌(alkalihalobacillussp.)paia262，于2023年3月23日包藏于中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno.63124。该专利文献中的碱性蛋白酶可应用于洗涤剂生产、皮革鞣制加工、食品加工、医药工业以及蛋白质废物处理等方面。

技术实现思路

1、本发明提供了一种具有高活性和耐受性的中性蛋白酶及其编码的基因和应用，以解决来源于天然的蛋白酶制剂对温度和ph敏感，易受外界环境影响而失活，无法满足工业生产需要的技术问题。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、能够编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的基因htpx，核苷酸序列如seq idno.1所示。

4、从东方蝼蛄肠道中提取出东方蝼蛄肠道全基因组，将东方蝼蛄肠道全基因组送至杭州联川生物技术股份有限公司进行宏基因组分析，将宏基因组结果通过kegg功能注释，预测获得了含有完整序列的蛋白酶基因htpx，蛋白酶基因htpx在kngg数据库中的编号为bg04_5331,cds号为to3825。根据东方蝼蛄肠道微生物宏基因组筛选获得的htpx蛋白酶基因序列设计含有限制性内切酶bamhi和smai识别位点的一对引物，正向引物的核苷酸序列5’-cgggat cctgctaaaacgaatttcactgttt-3’(下划线为bamhi的酶切位点)，如seq no.3所示，反向引物的核苷酸序列5’-tcccccgggttatagcgaatgcaagcgc-3’(下划线为smai的酶切位点)，如seq no.4所示，以提取的东方蝼蛄肠道微生物全基因组dna为模板，pcr扩增得到能够编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的基因htpx。

5、能够编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的基因htpx全长为873bp，编码中性蛋白酶的290个氨基酸，其核苷酸序列如seq no.1所示。

6、根据本发明的另一方面，还提供了一种具有高活性和耐受性的中性蛋白酶，其氨基酸序列如seq no.2所示。

7、根据本发明的另一方面，还提供了一种重组载体，包括将pcr产物表达载体pht43双酶切后纯化，在温度为16℃，t4连接酶作用下连接过夜，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，将感受态细胞涂布至含氯霉素的lb固体平板培养基中，37℃培养过夜，挑取单克隆，经菌液pcr验证阳性克隆后，保存菌种并测序。挑取菌液pcr验证阳性且测序结果正确的克隆，接种至含氨苄卡那霉素的lb液体培养基，37℃振荡培养过夜，提取质粒获得重组质粒pht43-htpx，电转化至枯草芽孢杆菌wb800n感受态细胞，稀释涂布在含氯霉素抗生素的lb平板筛选阳性转化子。

8、根据本发明的另一方面，还提供了一种重组菌株，该菌株于2023年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏机构2023年12月1日检测完毕，检测结果为存活，分类名为枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)，保藏编号为cctcc no：m20232325，保藏机构的地址位于中国武汉武汉大学，保藏机构简称cctcc。

9、重组菌株——保藏编号为cctcc m 20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht 43-htpx(bacillus subtilis)，包括上述重组表达载体——重组质粒pht43-htpx。

10、重组菌株——保藏编号为cctcc no：m 20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)，以1％～2％的比例接种于50毫升含氯霉素终浓度10微克/毫升的发酵培养基中，在温度为37℃、转速为180转/分钟的条件下培养至od600≈0.6～0.8，加入终浓度为1～4毫摩尔/升的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，在温度37℃、转速150～220转/分钟的条件下培养24～36小时诱导中性蛋白酶的产生，所制备的中性蛋白酶酶活力为321～998单位/毫升。

11、根据本发明的另一方面，还提供了一种重组菌株——保藏编号为cctccno：m20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)的构建方法，包括以下步骤：

12、6a、提供能够编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的基因htpx、表达载体和表达菌株；

13、6b、对能够编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶基因htpx进行扩增，扩增产物与表达载体pht43进行连接，获得重组表达载体pht43-htpx；

14、6c、将重组表达载体pht43-htpx整合到表达菌株——枯草芽孢杆菌wb800n感受态细胞，获得重组菌株——保藏编号为cctcc no：m 20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)。

15、所述的步骤6b中扩增是以提取的东方蝼蛄肠道微生物全基因组dna为模板，扩增的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如seq no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq no.4所示。

16、根据本发明的另一方面，还提供了一种制备具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的方法，该方法包括以下步骤：

17、(1)培养所述的重组菌株——保藏编号为cctcc no：m 20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)，诱导编码中性蛋白酶的基因htpx的表达；

18、(2)分离提纯所表达的中性蛋白酶。

19、根据本发明的另一方面，还提供了一种具有高活性和耐受性的中性蛋白酶、能够编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的基因htpx、含有基因htpx的重组载体pht43-htpx、含有重组载体的重组菌株——保藏编号为cctccno:m 20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)在降解牛皮和/或羊皮固废中的应用，中性蛋白酶在降解牛皮和/或羊皮固废中的反应温度为45℃～55℃，反应ph＝6.0～8.0。应用于羊皮固废降解时羊皮胶原蛋白回收率为10.22％～18.83％，应用于牛皮固废降解时牛皮胶原蛋白回收率为30.12％～50.85％。

20、本发明所具备的实质性特点以及取得的显著技术进步在于：

21、本发明充分挖掘了蝼蛄肠道中不可培养的酶资源，构建了编码具有高活性和耐受性的中性蛋白酶的基因htpx，其全长为873bp，利用其构建的重组菌株——保藏编号为cctcc no：m 20232325的枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)发酵制备的中性蛋白酶酶活可达321～998单位/毫升，具有较高的酶活。在ph＝3.0～10.0的缓冲液中均具有较好的耐受性，相对酶活均在50％以上，当ph＝6.0～8.0时37℃存放3天无酶活损伤。最适反应温度为45～55℃，在30～40℃条件下24小时内无酶活损失，45℃条件下24小时相对酶活保持在50％以上，从而较好地提高了中性蛋白酶的温度及ph耐受性。

22、本发明中的菌株于2023年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏机构2023年12月1日检测完毕，检测结果为存活，分类名为枯草芽孢杆菌wb800n/pht43-htpx(bacillus subtilis)，保藏编号为cctcc no：m20232325，保藏机构的地址位于中国武汉武汉大学，保藏机构简称cctcc。

23、除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。