一种β-1,4-半乳糖基转移酶突变体及利用该突变体制备乳糖-N-新四糖的应用的制作方法

本技术涉及微生物基因工程，尤其是涉及一种β-1,4-半乳糖基转移酶突变体及利用该突变体制备乳糖-n-新四糖的应用。

背景技术：

1、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)是人乳寡糖中重要的成分之一，具有增强人体免疫力，调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(efsa)、欧盟(eu)和美国食品药品管理局(fda)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前，lnnt的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法，其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。

2、在微生物内lnnt的合成前体包括胞内自身合成的核苷酸udp-glcnac、udp-gal以及外源添加的乳糖。其合成过程是，首先胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶lacy转运至胞内，然后和胞内udp-glcnac在异源表达的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶lgta催化下生成lntii。lntii和udp-gal继续被异源表达的β-1,4-半乳糖基转移酶lgtb催化生成lnnt。但目前lnnt的微生物合成产量仍然较低，无法满足大批量工业生产的需求。根据前期研究发现，β-1,4-半乳糖基转移酶是合成lnnt的关键酶。然而，β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galt)的工程原理尚不清楚，β-1,4-半乳糖基转移酶(hpgalt)的活性和不溶性表达较低等原因阻碍了lnnt的生物生产，因此对β-1,4-半乳糖基转移酶进行改造是非常有必要的。

技术实现思路

1、本技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种β-1,4-半乳糖基转移酶突变体及利用该突变体制备乳糖-n-新四糖的应用。

2、为实现上述目的，本技术采取的技术方案为：

3、第一目的，本技术提供了一种β-1,4-半乳糖基转移酶突变体，所述β-1,4-半乳糖基转移酶突变体为在seq id no:1的127、128、129、145位发生1)～18)的取代突变形成的突变体；

4、1)第127位由谷氨酸突变为谷氨酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

5、2)第127位由谷氨酸突变为组氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

6、3)第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

7、4)第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

8、5)第129位由天冬氨酸突变为精氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

9、6)第127位谷氨酸由突变为谷氨酰胺、第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

10、7)第127位谷氨酸由突变为谷氨酰胺、第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

11、8)第127位谷氨酸由突变为谷氨酰胺、第129位由天冬氨酸突变为精氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

12、9)第127位谷氨酸由突变为组氨酸、第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

13、10)第127位谷氨酸由突变为组氨酸、第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

14、11)第127位谷氨酸由突变为组氨酸、第129位由天冬氨酸突变为精氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

15、12)第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸、第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

16、13)第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸、第129位由天冬氨酸突变为精氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

17、14)第127位谷氨酸由突变为谷氨酰胺、第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸、第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

18、15)第127位谷氨酸由突变为谷氨酰胺、第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸、第129位由天冬氨酸突变为精氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

19、16)第127位谷氨酸由突变为组氨酸、第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸、第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸；

20、17)第127位谷氨酸由突变为组氨酸、第128位由天冬氨酸突变为丝胺酸、第129位由天冬氨酸突变为精氨酸和第145位由赖氨酸突变为亮氨酸。

21、本技术的β-1,4-半乳糖基转移酶突变体以来自helicobacter pylori的hpgalt(genbank：baa88524.1)为模板，对密码子优化后的hpgalt进行定点饱和突变以及组合，获得本技术的β-1,4-半乳糖基转移酶突变体。本技术明的β-1,4-半乳糖基转移酶突变体在基因工程化的细胞中合成乳糖-n-新四糖产量较高，效果十分显著，具有较高的应用价值。

22、其中，对hpgalt氨基酸序列(seq id no:1)进行了定点饱和突变，将氨基酸序列第145位残基进行定点饱和突变，赖氨酸(k)突变为亮氨酸(l)，获得菌株k145l，该菌株的产量达2.88g/l，比菌株l1315提高了21.52％。

23、在菌株k145l基础上，将酶hpgalt的第127、129位点的氨基酸分别突变为q(第127位谷氨酸由突变为谷氨酰胺)和n(第129位由天冬氨酸突变为天冬酰胺)，获得的菌株后命名为l1315lqn，该菌株合成乳糖-n-新四糖产量可高达4.56g/l，比野生型的hpgalt的产量提高了92.41％，并且该菌株在5l罐最高lnnt产量38.17g/l。

24、第二目的，本技术提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的β-1,4-半乳糖基转移酶突变体。

25、在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上用于下一步纯化与分析的分子标签，如组氨酸标签等。

26、第三目的，本技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括如上述多核苷酸。

27、在一优选实施例中，表达载体选自pet-hpgalt。

28、第四目的，本技术提供了一种基因工程化的细胞，所述细胞包括上述表达载体或多核苷酸。

29、作为本技术所述细胞的优选实施方式，所述细胞包括大肠杆菌。

30、在一优选实施例中，基因工程化的细胞可以为大肠杆菌、链霉菌、酵母菌等宿主微生物。

31、第五目的，本技术提供了上述β-1,4-半乳糖基转移酶突变体在制备乳糖-n-新四糖中的应用。

32、第六目的，本技术提供了一种非诊断和治疗目的的提高β-1,4-半乳糖基转移酶催化活性的方法，在生物酶法催化体系中，使用上述β-1,4-半乳糖基转移酶突变体。

33、与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：

34、本技术提供了一种β-1,4-半乳糖基转移酶突变体及利用该突变体制备乳糖-n-新四糖的应用，利用本技术的β-1,4-半乳糖基转移酶突变体可以显著提高乳糖-n-新四糖产量，其乳糖-n-新四糖的产量可高达4.56g/l，比野生型的hpgalt的产量提高了92.41％。并且利用β-1,4-半乳糖基转移酶突变体在基因工程化的细胞中进行5l罐分批补料发酵实验获得的最高lnnt产量可为38.17g/l，具有较高的应用价值。