一种重组大肠杆菌及其构建方法、以及应用与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法、以及应用。

背景技术：

1、色氨酸是人体必需氨基酸之一，又称α-氨基-β-吲哚丙酸，有3种同分异构体：l型、d型和消旋体dl型。l-色氨酸是人和动物必需的氨基酸，不能自身合成，只能通过食物摄取。l-色氨酸可以广泛使用于医药和营养保健、食品应用、饲料添加剂、农业及环境监测等方面。当今，l-色氨酸生产方法有提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法。化学合成法有酮肟酸酯法，其原理是将酮肟酸酯转化为色氨酸，然后再纯化，这种方法成本相对较低，但对环境污染较大。从植物中提取色氨酸，具有环保、无毒副作用等优点。但产量较低，且效率较低。

2、酶促转化法具有操作性强、可控性好、终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点。然而现有的酶法转化制备色氨酸需要多个酶分步骤进行反应、严格控制条件，工艺复杂，制备成本高，不利于大规模生产利用。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提出一种重组大肠杆菌及其构建方法、以及应用，旨在提供一种基因工程菌能够同时高效的表达两种酶，通过采用这两种酶可直接以廉价的甘氨酸和甲醛作为底物合成色氨酸，简化色氨酸酶法转化工艺，实现由甘氨酸和甲醛一步法转化为色氨酸的技术路线。

2、为实现上述目的，本发明提出一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌共表达丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶。

3、可选地，编码所述丝氨酸羟甲基转移酶的优化密码子序列，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

4、可选地，编码所述色氨酸酶的优化密码子序列，具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。

5、本发明还提出一种如上所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

6、s1、提取大肠杆菌基因组dna，以提取的基因组dna为模板，用设计的引物p-shmt进行pcr克隆丝氨酸羟甲基转移酶和引物p-tpase进行pcr克隆色氨酸酶基因，得到shmt基因和tpase基因；

7、s2、提取pet-28a质粒，分别酶切所述shmt基因、tpase基因、pet-28a质粒；

8、s3、利用t4 dna连接酶将酶切的shmt基因、tpase基因分别与pet-28a质粒连接，得到质粒pet28a-shmt和pet28a-tpase；

9、s4、用bglⅱ和hindⅲ双酶切质粒pet28a-tpase，回收纯化的含t7启动子的基因片段，用bamhⅰ和hindⅲ双酶切质粒pet28a-shmt，回收纯化的质粒片段；

10、s5、利用t4 dna连接酶将纯化的含t7启动子的基因片段和纯化的质粒片段连接，得到连接产物；

11、s6、将所述连接产物转入dh5a大肠杆菌感受态细胞，得到dh5a-pet28a-shmt-tpase双克隆基因工程菌，即重组大肠杆菌。

12、可选地，在步骤s1中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。

13、可选地，在步骤s2中，采用ncoⅰ和bamhⅰ酶切所述shmt基因，采用ncoⅰ和bamhⅰ酶切tpase基因，采用ncoⅰ和bamhⅰ酶切pet-28a质粒。

14、可选地，在步骤s5中，所述连接的温度为15～20℃；和/或，

15、所述连接的时间为8～20h。

16、本发明还提出一种如上所述的重组大肠杆菌的应用，将所述重组大肠杆菌用于发酵生产丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶。

17、可选地，所述发酵生产的最佳条件为iptg 0.6mmol/l iptg，在30℃条件下诱导4h。

18、可选地，应用于酶法生产色氨酸。

19、本发明的有益效果在于：

20、本发明提供的重组大肠杆菌能够同时高效的表达丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶两种酶，这样合成色氨酸的底物就可以是廉价的甘氨酸和甲醛，简化色氨酸酶法转化工艺，本发明采用优化的发酵工艺提高两种酶的产量，实现由甘氨酸和甲醛一步法转化为色氨酸的技术路线。

技术特征：

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌共表达丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述丝氨酸羟甲基转移酶的优化密码子序列，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述色氨酸酶的优化密码子序列，具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。

4.一种如权利要求1至3任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤s1中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。

6.如权利要求4所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤s2中，采用ncoⅰ和bamhⅰ酶切所述shmt基因，采用ncoⅰ和bamhⅰ酶切tpase基因，采用ncoⅰ和bamhⅰ酶切pet-28a质粒。

7.如权利要求4所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤s5中，所述连接的温度为15～20℃；和/或，

8.一种如权利要求1所述的重组大肠杆菌的应用，其特征在于，将所述重组大肠杆菌用于发酵生产丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶。

9.如权利要求8所述的重组大肠杆菌的应用，其特征在于，所述发酵生产的最佳条件为iptg 0.6mmol/liptg，在30℃条件下诱导4h。

10.如权利要求8所述的重组大肠杆菌的应用，其特征在于，应用于酶法生产色氨酸。

技术总结
本发明公开一种重组大肠杆菌及其构建方法、以及应用，所述重组大肠杆菌共表达丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶。本发明提供的重组大肠杆菌能够同时高效的表达丝氨酸羟甲基转移酶和色氨酸酶两种酶，这样合成色氨酸的底物就可以是廉价的甘氨酸和甲醛，简化色氨酸酶法转化工艺，本发明采用优化的发酵工艺提高两种酶的产量，实现由甘氨酸和甲醛一步法转化为色氨酸的技术路线。

技术研发人员：姜能桥,陈龙,姜刘唯,姜建桥
受保护的技术使用者：武汉康蓝药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24