一种CD73蛋白的检测方法、试剂盒及其应用与流程

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种cd73蛋白的检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、cd73又称为胞外5'-核苷酸酶，是由糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定于细胞膜表面的一种多功能跨膜糖蛋白，其分子量为70kda，由nt5e基因编码。最早，cd73被定义为淋巴细胞表面分化抗原，在t淋巴细胞中具有刺激信号分子的功能。随着研究的不断深入，人们发现cd73分子不仅存在于淋巴细胞中，而是在大多数组织中广泛存在，并且发挥多种不同的生理功能，如：上皮离子交换、液体转运、血小板功能、组织乏氧以及血管渗漏等。cd73具有水解酶和非水解酶功能。在肿瘤的发生发展过程中，cd73的水解酶与非水解酶功能并非独立存在，而是同时发挥作用并互相促进，共同参与维持肿瘤的演进。

2、cd73在多种恶性肿瘤组织中高表达，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及恶性黑色素瘤等。cd73在肿瘤微环境中，能够促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移。此外，它能够抑制保护性免疫细胞，如效应性t细胞、nk细胞和b细胞。增强抑制性免疫细胞，如肿瘤相关的巨噬细胞、髓系抑制性细胞和调节性t细胞。由此可见，cd73在肿瘤的进展过程中扮演着重要的角色，是肿瘤治疗的潜在靶标。

3、在肿瘤治疗过程中，采用免疫组织化学法检测患者肿瘤组织内靶蛋白的表达有利于治疗的决策，现有技术中，对于cd73蛋白的检测通常采用elisa试剂盒检测，存在时间较长、成本较高的缺陷。

4、因此，本领域亟需开发一种能够特异性好、便捷性高、易于操作且成本可控的cd73蛋白检测试剂盒及其方法，可用于进行cd73高表达相关癌症的cd73蛋白表达情况的体外检测，也可进一步用于预测和评估免疫治疗药物的效果。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种多肽，所述多肽特异性结合抗cd73抗体，所述多肽的氨基酸序列如seq no:1所示。

2、本发明的第二方面，提供一种检测cd73蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为包含特异性结合片段的cd73抗体，所述特异性结合片段为如seqno:1所示的氨基酸序列，所述第二抗体为polymer酶标二抗。

3、具体地，所述试剂盒还包括pbs缓冲液、抗原修复液、封闭液、显色液和复染液。

4、具体地，所述第一抗体的工作液的稀释比例为1：500～1：700。

5、具体地，所述封闭液为过氧化物酶封闭液。

6、具体地，所述显色液为dab显色液。

7、具体地，所述复染液为苏木素染液。

8、本发明的第三方面，提供一种前述的检测cd73蛋白的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

9、1)样本准备：

10、取待测组织的石蜡块，制成3～5μm的石蜡切片，于60℃恒温箱中烤片60min；

11、2)上机检测：

12、使用leica全自动免疫组化染色机，对样品进行免疫组化染色；

13、3)脱水透明：

14、将样品依次置于70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和无水乙醇中浸泡，每次浸泡时间为3min，其中，无水乙醇中浸泡两次；

15、之后，再浸泡两次二甲苯，每次浸泡时间为10min；

16、4)封片：

17、采用中性树胶对浸泡后的样品进行封片。

18、具体地，所述leica全自动免疫组化染色机的运行程序为：

19、1)脱蜡；

20、2)使用抗原修复液进行抗原修复10-12min；

21、3)使用过氧化物酶封闭液进行封闭5-10min；

22、4)加入第一抗体孵育30-60min；

23、5)加入第二抗体孵育8-10min；

24、6)使用dab显色液进行显色5-10min；

25、7)使用苏木素染液复染2-5min。

26、本发明的第四方面，提供了一种前述的检测cd73蛋白的试剂盒在筛选或制备防治疾病的药物中的应用，所述疾病为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

28、1.本发明提供的多肽，针对抗cd73抗体具有优良的检测特异性，从而帮助筛选出构建高特异性高灵敏度的cd73检测试剂盒的cd73抗体，进一步提升了cd73蛋白表达免疫组化染色检测的准确度。

29、2.本发明的检测cd73蛋白的试剂盒及其检测方法，操作简便、成本较低且适用性广，可以广泛适用于多种肿瘤疾病中cd73蛋白表达的体外检测诊断，且有利于筛选和预测多种cd73靶点的免疫治疗药物的效果。

技术特征：

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽特异性结合抗cd73抗体，所述多肽的氨基酸序列如seq no:1所示。

2.一种检测cd73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为包含特异性结合片段的cd73抗体，所述特异性结合片段的氨基酸序列如seqno:1所示，所述第二抗体为polymer酶标二抗。

3.根据权利要求2所述的检测cd73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pbs缓冲液、抗原修复液、封闭液、显色液和复染液。

4.根据权利要求2所述的检测cd73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体的工作液的稀释比例为1：500～1：700。

5.根据权利要求3所述的检测cd73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为过氧化物酶封闭液。

6.根据权利要求3所述的检测cd73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述显色液为dab显色液。

7.根据权利要求3所述的检测cd73蛋白的试剂盒，其特征在于，所述复染液为苏木素染液。

8.一种权利要求2-7中任一项所述的检测cd73蛋白的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测cd73蛋白的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述leica全自动免疫组化染色机的运行程序为：

10.一种权利要求2-7中任一项所述的检测cd73蛋白的试剂盒在筛选或制备防治疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤。

技术总结
本发明公开了一种CD73蛋白的检测方法、试剂盒及其应用，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为包含特异性结合片段的CD73抗体，所述特异性结合片段为如SEQ NO:1所示的氨基酸序列，所述第二抗体为Polymer酶标二抗，所述方法为基于前述试剂盒对待测样品进行免疫组化染色。本发明提供的试剂盒和检测方法，特异性好、便捷性高、易于操作且成本可控，在进行CD73高表达相关癌症的CD73蛋白表达情况的体外检测方面具有良好前景，也可进一步用于预测和评估免疫治疗药物的效果。

技术研发人员：施丽君,高晓月,杨超超
受保护的技术使用者：苏州药明泽康生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6