一种识别MAGE-A3抗原短肽的T细胞受体及其应用

本发明涉及生物，具体地，涉及一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体及其应用。

背景技术：

1、mage-a3是黑色素瘤抗原基因(mage)家族中具有独特特征的一个抗原，mage家族是原癌抗原，是癌睾丸(cancer/testis antigen)抗原超家族成员之一，其家族成员超过60个，均存在于同一个mage同源结构域。主要分为两个亚类：mage-i类抗原和mage-ii类抗原。mage-ii类抗原的表达普遍存在于正常细胞中，而mage-i类抗原为肿瘤特异性抗原，即在人体除睾丸生殖细胞和胎盘字样组织以外的组织中均不表达，而在肿瘤中高表达，是肿瘤研究中的热点。生殖细胞缺乏hla，因而癌睾丸抗原不能被t细胞识别；但在恶性肿瘤中，癌睾丸抗原和hla分子同时表达，因而可以被t细胞识别。

2、mage-i类抗原可划分为三个亚类：mage-a、mage-b和mage-c。mage-a亚家族具有严格的表达模式，其中mage-a3在肿瘤中特异性高表达而成为了焦点，65％的黑色素瘤患者存在mage-a3特异性高表达，在非小细胞肺癌(nsclc)患者中这一比例高达85％。此外，mage-a3还在多种肿瘤中高表达，如肝癌(zang c，et al.bmc cancer.2021.21(1):1007)、头颈肿瘤(cesson v，et al.cancer immunol immunother.2011.60(1):23-35)、骨肉瘤(conleyap，et al.cancers(basel).2019.11(5):677)及食管癌(chen x，et al.int jcancer.2018.143(10):2561-2574)等。对于上述肿瘤，通常采用化疗和放射性治疗等方法，当疗效较差且有验证不良反应。

3、mage-a3抗原在蛋白酶体中被降解成小肽片段，并释放到细胞质中，然后通过于抗原呈递(tap)相关的转运蛋白转运到内质网(er)，形成i类mhc(主组织相容性复合体)分子及肽的稳定复合物(pmhc)，然后通过高尔基体将pmhc运输到细胞表面被t细胞表面的抗原识别受体(tcr)识别。lvfgielmev是衍生自mage-a3抗原的表位肽，是mage-a3抗原高表达相关肿瘤治疗的一种靶标。

4、t细胞是杀伤肿瘤细胞的重要力量，t细胞的活化和杀伤作用是由tcr特异性识别mhc处理递呈的抗原肽来街道的，借助基因改造技术可以研制出高亲和性的tcr。目前，“工程”t细胞技术(t-cell engineering technology)在很大程度上客服了传统肿瘤化疗和放疗的障碍，主要包括嵌合抗原受体t细胞(car-t)和t细胞受体t细胞(tcr-t)两大类。car-t细胞治疗需要癌细胞表面表达特异性的肿瘤抗原，因此不适用于杀伤mage-a3高表达的肿瘤。

5、tcr-t细胞疗法则是将能识别肿瘤特异性抗原的tcrα和tcrβ链基因转染到t细胞中，使t细胞的tcr抗原结合区发生结构改变，从而能特异性识别相应的肿瘤抗原，然后经过体外扩增并回输到人体内，表达肿瘤抗原特异性tcr的t淋巴细胞(可识别肿瘤细胞表面的hla-肽复合物)，进而引发t细胞的免疫效应，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

6、因此，筛选出对mage-a3抗原表位肽具有特异性的tcr，以及将该tcr转导t细胞以获得对mage-a3抗原表位肽具有特异性的t细胞对于细胞免疫治疗有着重大意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体及其应用。

2、本发明的第一目的是提供一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体。

3、本发明的第二目的是提供一种tcr-t细胞。

4、本发明的第三目的是提供一种重组表达载体。

5、本发明的第四目的是提供一种宿主细胞。

6、本发明的第五目的是提供一种药物组合物

7、本发明的第六目的是提供上述t细胞受体、tcr-t细胞、核酸分子、重组表达载体\宿主细胞和/或药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

8、本发明的第七目的是提供上述t细胞受体、tcr-t细胞、核酸分子、重组表达载体\宿主细胞和/或药物组合物在制备抗肿瘤的疫苗中的应用。

9、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

10、一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体，所述t细胞受体为以下的一种：

11、包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：1所示tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seqid no：6所示的tcrβ肽链；

12、包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：2所示tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seqid no：7所示的tcrβ肽链；

13、包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：3所示tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seqid no：8所示的tcrβ肽链；

14、包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：4所示tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seqid no：9所示的tcrβ肽链；

15、包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：5所示tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seqid no：10所示的tcrβ肽链。

16、优选地，所述t细胞受体为以下的一种：

17、包括氨基酸序列如seq id no：11所示的tcrα肽链和氨基酸序列如seq id no：16所示的tcrβ肽链；

18、包括氨基酸序列如seq id no：12所示的tcrα肽链和氨基酸序列如seq id no：17所示的tcrβ肽链；

19、包括氨基酸序列如seq id no：13所示的tcrα肽链和氨基酸序列如seq id no：18所示的tcrβ肽链；

20、包括氨基酸序列如seq id no：14所示的tcrα肽链和氨基酸序列如seq id no：19所示的tcrβ肽链；

21、包括氨基酸序列如seq id no：15所示的tcrα肽链和氨基酸序列如seq id no：20所示的tcrβ肽链。

22、优选地，所述t细胞受体为靶向mage-a3抗原表位肽的t细胞受体；所述mage-a3抗原表位肽的氨基酸序列如seq id no：21所示。

23、mage-a3抗原表位肽(seq id no：21)：lvfgielmev。

24、一种tcr-t细胞，所述tcr-t细胞含有上述t细胞受体。

25、一种tcr-t细胞的制备方法，包括以下步骤：

26、s1.合成编码上述t细胞受体的tcrα肽链和tcrβ肽链的核苷酸序列，转化至18121质粒中，得到重组质粒；

27、s2.利用293t细胞对步骤s1得到的重组质粒进行慢病毒包装，得到tcr慢病毒；

28、s3.利用步骤s3得到的tcr慢病毒感染jurkat76细胞得到感染后细胞，筛选tcr表达阳性的感染后细胞，即为tcr-t细胞。

29、一种重组表达载体，所述重组表达载体为包含编码上述tcrα链和tcrβ链的核苷酸序列的表达载体。

30、优选地，所述表达载体为phiv-zsgreen(plasmid#18121)。

31、一种宿主细胞，包含上述t细胞受体和/或上述重组表达载体。

32、一种药物组合物，所述药物组合物含有上述t细胞受体、上述tcr-t细胞、上述重组表达载体和/或上述宿主细胞的一种或几种，还含有药学上接受的载体。

33、本发明还请求保护上述t细胞受体、上述tcr-t细胞、上述重组表达载体、上述宿主细胞和/或上述药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

34、优选地，所述肿瘤为表达黑色素瘤相关抗原a3的肿瘤(mage-a3)。

35、更优选地，所述黑色素瘤相关抗原a3(mage-a3)的氨基酸序列如seq id no：21所示。

36、更优选地，所述肿瘤为肺癌、黑色素瘤、肝癌、头颈肿瘤、食管癌和/或骨肉瘤。

37、进一步优选地，所述肿瘤为肺癌。

38、本发明还请求保护上述t细胞受体、上述tcr-t细胞、上述重组表达载体、上述宿主细胞和/或上述药物组合物在制备抗肿瘤的疫苗中的应用。

39、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

40、本发明提供了一种识别mage-a3抗原短肽的t细胞受体，所述t细胞受体为以下的一种：包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：1所示的tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seqid no：6所示的tcrβ肽链；包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：2所示的tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seq id no：7所示的tcrβ肽链；包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：3所示的tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seq id no：8所示的tcrβ肽链；包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：4所示的tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seq id no：9所示的tcrβ肽链；包括cdr3区氨基酸序列如seq id no：5所示的tcrα肽链和cdr3区氨基酸序列如seq id no：10所示的tcrβ肽链。本发明所述t细胞受体能够靶向mage-a3抗原表位肽(seq id no：21)，利用本发明所述t细胞受体构建t细胞受体t细胞(tcr-t)，对于表达黑色素瘤相关抗原a3的肿瘤具有显著的杀伤效果。本发明为黑色素瘤相关抗原a3相关的肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。