一种人心脏组织消化专用试剂盒及消化方法、检测方法与流程

本发明涉及组织消化，具体涉及一种人心脏组织消化专用试剂盒及消化方法、检测方法。

背景技术：

1、心血管疾病是一种严重威胁人类、特别是50岁以上中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。据世卫组织统计，心血管疾病是全球的头号死因，每年死于心血管疾病的人数多于其它任何病因。基于疾病发病机制开展的相关研究，成为当前研究的热点，其中细胞疾病模型在这一研究中发挥的作用无可替代，尤其是具备正常生理功能的人心脏组织单细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础，因此高质量的人心脏组织单细胞悬液的获得对成功研究心脏疾病的发生发展至关重要。如果能够有一种人心脏组织消化专用试剂盒来制备人心脏组织单细胞悬液，必将会为我们深入理解心血管相关疾病的发病机制及制定治疗策略带来极大的益处。

2、心脏是哺乳动物循环系统的核心。作为机体重要的功能性器官，心脏的细胞组成复杂。在肝脏、脾脏等血窦丰富、胶原纤维少的器官，制备单细胞悬液较为容易，对脏器进行研磨即可，而在心脏这一肌性器官，富含胶原纤维、结缔组织及细胞间较为致密的结构极大增加了心脏组织的解离难度，难以获得高得率和活率的心脏组织单细胞悬液，进而制约了许多研究。目前文献中有见到对动物心脏组织采用胰蛋白酶、胶原酶或者胰蛋白酶-胶原酶联合消化法来制备心脏组织单细胞悬液，但如何高质量的获取高得率和活率的人心脏组织单细胞悬液供后续研究，还缺乏系统、详尽的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种人心脏组织消化专用试剂盒及消化方法、检测方法，以解决现有技术的不足。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种人心脏组织消化专用试剂盒，包括c液、h液、d液、f液、p1液、p2液和a液；

4、所述c液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：胶原酶a 20，牛血清白蛋白2.5，葡萄糖0.1125，l-谷氨酰胺0.0146，余量为水；

5、所述h液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：透明质酸酶2.5，牛血清白蛋白2.5，葡萄糖0.1125，l-谷氨酰胺0.0146，余量为水；

6、所述d液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：脱氧核糖核酸酶1，tirs-hcl 1.576，nacl 8.766，mgcl2 0.2033，余量为水，然后与等体积的甘油混合；

7、所述f液为facs buffer，是由以下浓度的组分组成：0.5wt％牛血清白蛋白，2mmedta，余量为pbs；

8、所述p1液为36v/v％percoll；

9、所述p2液为72v/v％percoll；

10、所述a液为ack红细胞裂解液，是由以下浓度的组分组成：以1l水为基准，nh4cl8.29g、khco3 1.00g、na2edta 37.2mg，溶于1l水中，用koh和hcl调节ph至7.2-7.4。

11、本发明第二方面提供了一种人心脏组织消化方法，利用上述人心脏组织消化专用试剂盒进行人心脏组织消化，包括如下步骤：

12、步骤一、储备液稀释、混合：将c液、h液和d液分别用rpmi 1640培养基稀释10、10、50倍，然后将稀释好的c液、h液和d液按体积比5:1:1混合，得到人心脏组织消化液；

13、步骤二、人心脏组织清洗、称重：使用rpmi 1640培养基对人心脏组织进行多次清洗，然后弃去多余rpmi 1640培养基，称重，人心脏组织按0.1-1g转入一消化管中；

14、步骤三、粉碎人心脏组织：用剪刀将步骤二消化管中的人心脏组织剪碎，使人心脏组织碎块尽可能细小；

15、步骤四、消化人心脏组织：步骤三的一消化管中加入700ul步骤一人心脏组织消化液，用rpmi 1640培养基补全至5ml体系，37℃、145rpm水浴消化60min；

16、步骤五、过滤离心：将步骤四得到的人心脏组织消化液过70μm滤筛，并使用50ml f液冲洗消化管与滤筛，收集滤液，于400g室温离心10min，弃上清，得到沉淀；

17、步骤六、过percoll：使用3ml p1液重悬步骤五的沉淀铺于2ml p2液上，再在最上层铺3ml pbs，400g室温离心30min，取中间细胞层，用f液清洗，然后400g室温离心5min，弃上清，得到沉淀；

18、步骤七、裂解红细胞：于步骤六的沉淀中加入1ml a液裂解红细胞，1min内加入5mlf液终止裂解，然后400g室温离心5min，弃上清，得到沉淀；若红细胞未裂解完再裂解一次；

19、步骤八、计数：用1ml f液重悬步骤七的沉淀即得到人心脏组织单细胞悬液，取10ul在显微镜下计数，分别计算活细胞、死细胞数及活率。

20、本发明第三方面提供了一种人心脏组织单细胞悬液的检测方法，所述检测方法检测的人心脏组织单细胞悬液由上述人心脏组织消化方法获得，所述检测方法包括：取人心脏组织单细胞悬液，加入cd45、hla_dr、cd3的抗体，标记所述的人心脏组织单细胞悬液中的白细胞、粒细胞、t淋巴细胞，用质谱流式进行检测：

21、先选取cd45标记的白细胞，再分析cd45阳性细胞中被标记了hla_dr、cd3的细胞亚群，从而获得人心脏组织中白细胞、粒细胞、t淋巴细胞在总心脏组织细胞中的占比情况。所述检测方法能够分析人心脏组织单细胞悬液中的不同细胞亚群。

22、本发明的有益效果：

23、本发明的人心脏组织消化专用试剂盒、人心脏组织消化方法及检测方法，解决了现有技术未提供具体的人心脏组织单细胞悬液制备以及检测方法的问题，具有以下优点：

24、(1)根据人心脏组织的特点，本发明的人心脏组织消化液首次创新性地采用了新型组合酶消化体系，包括：胶原酶a、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶，多种酶联合消化法实现了高的心脏组织细胞得率和活率；

25、胶原酶a主要水解心脏结缔组织中胶原蛋白成分，从而使细胞离散；

26、透明质酸酶能特异性裂解透明质酸聚糖链，降解组织中的透明质酸；心脏组织富含透明质酸，尤其是心包内和心肌细胞之间，通过采用透明质酸酶来降解心脏组织中富含的透明质酸、消化心肌细胞之间的结构，提高了心脏组织分离效率，更好地分离出心脏组织中的细胞组分；

27、脱氧核糖核酸酶消化受损细胞泄露到外界的dna，从而降低粘度，去除膜结合的dna片段，减少细胞聚集。

28、本发明的人心脏组织消化液未使用胰蛋白酶，以减少对细胞的破坏作用。

29、(2)本发明的人心脏组织消化专用试剂盒及人心脏组织消化方法能够稳定、可靠地消化人心脏组织，产出高细胞产量、高细胞活率的单细胞悬液，获得的细胞数目较高，对细胞损伤小、细胞得率高、细胞活率高，而且消化方法简单易行。

30、(3)本发明的人心脏组织单细胞悬液的检测方法是先选取cd45标记的白细胞，再分析cd45阳性细胞中被标记了hla_dr、cd3的细胞亚群，从而获得人心脏组织中白细胞、粒细胞、t淋巴细胞在总心脏组织细胞中的占比情况，所述检测方法简单，能够同时快速、准确分析人心脏组织单细胞悬液中的不同细胞亚群(具有不同细胞抗原的细胞群体)，非常有助于我们深入理解心脏在发育、疾病中的特征性变化，为后续的科学研究提供依据。