一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法与流程

本发明涉及寡核苷酸，特别涉及到一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法。

背景技术：

1、荧光标记的核酸序列常被用于疾病的检测、辅助诊断、诊断。目前的荧光标记的核酸都是通过化学合成的方法制得。化学合成脱氧核糖寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从而将多个核苷酸单元连接为脱氧核糖寡核苷酸链的过程。

2、目前主流的寡核苷酸hplc纯化方法采用的是阴离子交换层析法，例如现有技术cn117143165a的中国专利公开了一种寡核苷酸的纯化方法，将寡核苷酸粗品装载到用磷酸盐缓冲溶液平衡后的阴离子交换柱上，用磷酸盐缓冲溶液平衡阴离子交换柱后，用磷酸盐缓冲溶液和含碱金属卤化物的磷酸盐缓冲溶液的混合物洗涤阴离子交换柱，再用磷酸盐缓冲溶液平衡阴离子交换柱，然后用酸性水溶液洗涤阴离子交换柱使得寡核苷酸的末端核苷的羟基保护基脱除并用磷酸盐缓冲溶液平衡所述阴离子交换柱，最后用含碱金属卤化物的磷酸盐缓冲液洗脱脱除羟基保护基的目标寡核苷酸，收集包含目标寡核苷酸的洗脱液。

3、但是申请人发现：一方面，目前阴离子交换层析所用填料价格较高，带来的成本很高，而且荧光标记后的寡核苷酸还会对其填料存在染色问题，导致无法清洗；另一方面，由于寡核苷酸的结构中含有amino-c6基团，含有此基团的寡核苷酸会与阴离子交换层析法中所用填料间发生结合紧密的现象，导致使用高浓度的含碱金属卤化物的盐溶液也无法完全洗脱，从而造成纯化效率的大大降低。

技术实现思路

1、基于此，本发明采用c18反相纯化方式，解决含amino-c6基团寡核苷酸无法洗脱问题，并引入荧光基团。

2、本发明提供一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，主要包括以下步骤：

3、a)基于氨解反应合成带有amino-c6基团的寡核苷酸粗产物，并对氨解后得到的粗产物进行超滤；主要是对寡核苷酸进行氨基修饰，接入amino-c6基团。

4、b)基于反相纯化原理对超滤处理后的寡核苷酸进行纯化；主要是为了纯化中间体--带有amino-c6基团的寡核苷酸，实现非目标产物的有效分离，去除n-、p＝o等杂质。

5、c)对纯化后的寡核苷酸进行超滤脱盐，并使用离心真空浓缩仪抽干其水分；以去除合成过程中多余的盐。

6、d)基于酯化反应原理，将荧光标记物与上述步骤c中带有amino-c6基团的寡核苷酸进行偶联反应，得到末端含有偶联荧光标记物的寡核苷酸；主要是将荧光标记物偶联到c6氨基上。

7、e)基于反相纯化原理对含有偶联荧光标记物的寡核苷酸进行纯化，最终得到带有荧光标记物的寡核苷酸；主要是为了纯化含有偶联荧光标记物的寡核苷酸，实现非目标产物的有效分离，分离中间体--带有amino-c6基团的寡核苷酸。

8、f)对带有荧光标记物的寡核苷酸进行hplc检测，若hplc纯度合格，则对样品进行进一步超滤浓缩后冻干。

9、具体地，所述步骤b中：采用teaa水溶液作为流动相a，采用高极性有机溶剂作为流动相b，将超滤处理后含有amino-c6基团的寡核苷酸装载到使用teaa平衡后的反相色谱柱中，用teaa溶液平衡载样后的反相色谱柱，再用高极性有机溶剂梯度洗脱上述寡核苷酸，并收集含有amino-c6基团的寡核苷酸的馏分，完成纯化。

10、具体地，所述步骤e中：采用teaa水溶液作为流动相a，采用高极性有机溶剂作为流动相b，将含有偶联荧光标记物的寡核苷酸装载到使用teaa平衡后的反相色谱柱中，用teaa溶液平衡载样后的反相色谱柱，再用高极性有机溶剂梯度洗脱上述寡核苷酸，并收集含有偶联荧光标记物的寡核苷酸的馏分，完成纯化。

11、其中，所述流动相a的浓度为0.05m～0.2m，ph为6.0～8.0。

12、进一步优选地是，所述流动相a的浓度为0.1m～0.15m，ph为7.0～7.5。

13、其中，所述高极性有机溶剂采用甲醇、乙腈、乙醇中的一种或多种混合物。

14、其中，所述使用teaa平衡反相色谱柱中，teaa的用量为3～10个柱体积。

15、其中，所述荧光标记物选用cy3、cy5、cy5.5或cy7。

16、本发明具有如下技术效果：本发明首先采用氨解反应合成带有c6氨基的寡核苷酸，再对粗产物进行纯化以去除杂质，之后进行超滤脱盐以除去多余的盐，接着将荧光标记物偶联到c6氨基基团上，再对产物进行纯化以去除其中的中间体等杂质并得到最终产物。该纯化方法不同于传统阴离子交换层析法，不仅成本低，而且出现无法洗脱样品的现象更少，采用反相c18纯化方式的产率更高。

技术特征：

1.一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述步骤b中：采用teaa水溶液作为流动相a，采用高极性有机溶剂作为流动相b，将超滤处理后含有amino-c6基团的寡核苷酸装载到使用teaa平衡后的反相色谱柱中，用teaa溶液平衡载样后的反相色谱柱，再用高极性有机溶剂梯度洗脱上述寡核苷酸，并收集含有amino-c6基团的寡核苷酸的馏分，完成纯化。

3.根据权利要求1所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述步骤e中：采用teaa水溶液作为流动相a，采用高极性有机溶剂作为流动相b，将含有偶联荧光标记物的寡核苷酸装载到使用teaa平衡后的反相色谱柱中，用teaa溶液平衡载样后的反相色谱柱，再用高极性有机溶剂梯度洗脱上述寡核苷酸，并收集含有偶联荧光标记物的寡核苷酸的馏分，完成纯化。

4.根据权利要求2或3所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述流动相a的浓度为0.05m～0.2m，ph为6.0～8.0。

5.根据权利要求4所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述流动相a的浓度为0.1m～0.15m，ph为7.0～7.5。

6.根据权利要求2或3所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述高极性有机溶剂采用甲醇、乙腈、乙醇中的一种或多种混合物。

7.根据权利要求2或3所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述使用teaa平衡反相色谱柱中，teaa的用量为3～10个柱体积。

8.根据权利要求1所述的一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，其特征在于，所述荧光标记物选用cy3、cy5、cy5.5或cy7。

技术总结
本发明公开了一种带有荧光标记物的寡核苷酸的纯化方法，方法具体包括基于氨解反应合成带有Amino‑C6基团的寡核苷酸粗产物，并对氨解后得到的粗产物进行超滤；基于反相纯化原理对超滤处理后的寡核苷酸进行纯化；对纯化后的寡核苷酸进行超滤脱盐，并使用离心真空浓缩仪抽干其水分；基于酯化反应原理，将荧光标记物与上述步骤c中带有Amino‑C6基团的寡核苷酸进行偶联反应；基于反相纯化原理对含有偶联荧光标记物的寡核苷酸进行纯化，最终得到带有荧光标记物的寡核苷酸；对带有荧光标记物的寡核苷酸进行HPLC检测，若HPLC纯度合格，则对样品进行进一步超滤浓缩后冻干。本发明采用C18反相纯化方式，解决含Amino‑C6基团寡核苷酸无法洗脱问题，并引入荧光基团。

技术研发人员：赵海,王士强,王云端
受保护的技术使用者：苏州欧利生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17