一种葡萄黑根病的三重实时荧光定量检测方法

本发明属于植物真菌病原物分子检测，具体涉及一种三重荧光定量pcr检测葡萄黑根病病原菌的方法。

背景技术：

1、葡萄黑根病于1961年在法国首次报道，随后在世界各葡萄种植区普遍发生，如西班牙、意大利，智利，澳大利亚，黎巴嫩，新西兰、葡萄牙、中国等，且危害严重。我国于2021在新疆、宁夏、山西、河北、广西等地首次发现并报道葡萄黑根病，田间症状主要表现为葡萄植株枝条节间缩短和叶片黄化、根部表现为褐色至黑色坏死。在苗圃和新定植的葡萄园中易发生，最终导致树势衰弱甚至植株死亡。

2、葡萄黑根病病原菌复杂多样，主要属于丛赤壳科(nectriaceae)中8个属，包括campylocarpon、柱孢属(cylindrocarpon)、小帚梗柱孢属(cylindrocladiela)、dactylonectria、土赤壳属(ilyonectria)、新丛赤壳属(neonectria)、乳突赤壳属(thelonectria)和pleiocarpon。我国已报道能引起葡萄黑根病的病原菌共有11种，主要包括在cylindrocladiela、dactylonectria、ilyonectria 3个属中。其中i.liriodendri是首个报道与葡萄黑根病相关的致病菌，目前在全球十六个国家均有报道。

3、葡萄黑根病症状复杂，病原菌种类繁多，且与多种其他葡萄病害常常复合侵染，在田间难以直接辨别，需要通过病原菌的精准鉴定才能明确是否为葡萄黑根病。目前，对葡萄黑根病菌的鉴定主要结合病原菌的形态特征、生物学特性和单基因或多基因的系统进化树结果，存在工作量大、鉴定周期长且只能在病害显症后进行鉴定的问题。因此开发一种对该病害病原菌快速、准确的检测方法，可以早期准确检测出葡萄黑根病相关病原菌的存在，明确病害种类，有助于及时采取措施进行防治，建立更好的葡萄园管理措施，限制病害传播，减少葡萄黑根病带来的损失。

4、与传统pcr检测技术相比，qpcr具有一定优势：dna扩增后无需电泳检测，且能够实现对病原菌的定量检测，灵敏度更高，目前广泛应用于病原菌检测。传统pcr可以通过不同片段大小的扩增产物实现多重检测，qpcr可通过染料法中扩增产物tm值的不同或探针法使用不同类型荧光基团来修饰探针，实现2种或多种病原菌的同步检测。

5、由于葡萄黑根病菌种类繁多，因此需要建立一种多重实时荧光定量检测技术，对我国葡萄黑根病菌优势种进行一个较为全面的了解。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供一种多重实时荧光定量检测方法。本发明的原理在于设计不同特异性引物，并选择使用不同类型的荧光基团来修饰探针，从而实现多重qpcr检测。

2、本发明的第一个目的为提供了一组三重qpcr检测引物及探针组合：

3、本发明提供的用于检测葡萄黑根病菌的三重实时荧光定量pcr引物组，由1)-3)项所述的引物组组成：

4、1)检测cylindrocarpon lageniformis的引物组，其序列如下所示：

5、引物qbfd-tef-c.l-f1:ccttgtgcttgtagtggg(序列1)，

6、引物qbfd-tef-c.l-r3:tgcggttagtgaaaatgtaa(序列2)；

7、2)检测dactylonectria spp.的引物组，其序列如下所示：

8、引物qbfd-tef-d5-f1:gcttgctgacctgactcc(序列4)，

9、引物qbfd-tef-d5-r2:cgagataaggcggtcatggt(序列5)；

10、3)检测ilyonectria liriodendri的引物及探针，其序列如下所示：

11、引物qbfd-tub-i.l-f3:aatggtgtctacaacggtacctcc(序列7)，

12、引物qbfd-tub-i.l-r5:cgtggtgtgagtttgacacttcat(序列8)。

13、本发明提供的用于检测葡萄黑根病菌的三重实时荧光定量pcr的探针组，由1)-3)项所述的探针组成：

14、1)检测cylindrocarpon lageniformis探针，其序列如下所示：

15、探针c.l-2:cgccactactgcacatcactg(序列3)；

16、2)检测dactylonectria spp.的探针，其序列如下所示：

17、探针d spp.-2:ttcgtactaccacatcgttcttcgag(序列6)；

18、3)检测ilyonectria liriodendri的探针，其序列如下所示：

19、探针i.l-1:gagcgtctacttcaacgaggtacg(序列9)。

20、所述cylindrocarpon lageniformis探针c.l-2，5’端标记的荧光基团及3’端淬灭基团为fam、bhq1，dactylonectria spp.探针dspp.-2标记的荧光基团及淬灭基团为cy5、bhq3、ilyonectria liriodendri探针i.l-1标记的荧光基团及端淬灭基团为hex、bhq2。

21、本发明还提供一种检测葡萄黑根病菌的试剂盒，包括：所述的引物组和所述的探针组。

22、本发明的第二目的在于提供上述引物组、探针组和试剂盒在检测多种葡萄黑根病菌中的应用。所述葡萄黑根病菌为c.lageniformis、dactylonectria spp.(d.alcacerensis、d.palmicola、d.macrodidyma、d.torresensis、d.novozelandicah)、和i.liriodendri中的一种或两种以上任意组合。

23、本发明提供的葡萄黑根病菌的分子检测方法，是利用三重qpcr方法同时检测多种葡萄黑根病菌，包括以下步骤：

24、(1)提取样品基因组dna；

25、(2)用所述的试剂盒进行三重qpcr扩增。

26、(3)结果判定依据为相应的探针荧光信号及扩增曲线ct值；

27、当只有fam通道有扩增曲线且ct≤33时，样本中检出c.lageniformis；

28、当只有cy5通道有扩增曲线且ct≤33时，样本中检出dactylonectriaspp.；

29、当只有hex通道有扩增曲线且ct≤33时，样本中检出i.liriodendra；

30、当fam、cy5和hex通道均无扩增曲线或ct>35时，表明该检测样品无上述葡萄黑根病菌；

31、当fam、cy5和hex荧光通道有扩增曲线但33<ct≤35时，重复检测，若荧光通道ct≤35时，判断为阳性，否则为阴性。

32、所述反应体系为20μl，通过对引物及探针反应浓度进行优化，得到最终葡萄黑根病菌三重qpcr检测体系：

33、检测c.lageniformis的引物qbfd-tef-c.l-f1，终浓度为0.4μmol/l；

34、检测c.lageniformis的引物qbfd-tef-c.l-r3，终浓度为0.4μmol/l；

35、检测c.lageniformis的探针c.l-2，终浓度为0.2μmol/l；

36、检测dactylonectria spp.的引物qbfd-tef-d5-f1，终浓度为0.1μmol/l；

37、检测dactylonectria spp.的引物qbfd-tef-d5-r2，终浓度为0.1μmol/l；

38、检测dactylonectria spp.的探针d spp.-2，终浓度为0.4μmol/l；

39、检测i.liriodendri的引物qbfd-tub-i.l-f3，终浓度为0.2μmol/l；

40、检测i.liriodendri的引物qbfd-tub-i.l-r5，终浓度为0.2μmol/l；

41、检测i.liriodendri的探针i.l-1，终浓度为0.4μmol/l；

42、2×premix ex taq(probe qpcr)，10μl

43、rox reference dyeⅱ(50×)，0.2μl

44、dna 2μl，ddh2o up to 20μl。

45、葡萄黑根病菌三重qpcr反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火/延伸34s，40个循环。

46、检测结果判定方法：

47、当只有fam通道有扩增曲线且ct≤33时，样本中检出c.lageniformis；

48、当只有cy5通道有扩增曲线且ct≤33时，样本中检出dactylonectria spp.；

49、当只有hex通道有扩增曲线且ct≤33时，样本中检出i.liriodendra；

50、当fam、cy5和hex通道均无扩增曲线或ct>35时，表明该检测样品无上述葡萄黑根病菌。

51、当fam、cy5和hex荧光通道有扩增曲线但33<ct≤35时，重复检测，若荧光通道ct≤35时，判断为阳性，否则为阴性；

52、4、本发明的有益效果在于:

53、1)可同时检测出多种葡萄黑根病菌，提高了检测效率。

54、2)降低检测成本，一次可以检测多种目标病原菌，不需要多步复杂的反应及电泳检测，操作更加简便快速。

55、3)检测特异性高，所使用引物和探针均经过特异性筛选获得，同时使用探针法也提高了检测的特异性，降低了假阳性现象的出现。

56、本发明设计了三组特异性引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了三重实时荧光定量pcr检测方法，能够同时检测出多种葡萄黑根病菌。所提供的分子检测方法可用于对葡萄黑根病菌纯培养的检测鉴定，也能对葡萄病样进行检测。本发明的检测引物特异性强、灵敏度较高、操作简便，能够实现葡萄黑根病菌的早期检测，对葡萄黑根病的早期预警和防控具有重要意义。