一株高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一株高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、植物激素脱落酸(abscisic acid，aba)具有多种功能，除了能够诱导植物抗逆基因表达，激活植物体内的抗逆免疫系统，提高植物自身对极端环境的抗性外，还具有促进种子和果实贮存蛋白与糖分的积累，控制花芽分化以及调节花期等特性。近来，还发现脱落酸具有药理活性，可以刺激胰岛素分泌和抗炎反应，以及降低疟疾的严重程度。

2、人们首先尝试在植物中提取脱落酸，这一方法获得的脱落酸为天然型脱落酸，但是植物体内的(+)aba含量极低，每200千克的棉桃仅能提取9毫克脱落酸晶体。人们也尝试通过化学合成脱落酸，但是得到的产物为天然型(+)aba和非天然型(-)aba的混合物，而这两种光学构型的脱落酸存在很大的活性差异。相比植物提取法和化学合成而言，微生物发酵法生长周期短且可全天候生产、同时具有原料可再生、反应温和且可实现高效生产的优势，因此用微生物生产脱落酸是一种经济高效的方式。但是，现有技术中，缺乏能够高效生产脱落酸的微生物。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一株高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌。

2、本发明再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，该方法高效，操作简单。

3、本发明的再一目的是提供所述重组解脂耶氏酵母菌在生产脱落酸中的应用。

4、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

5、一株高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌，在解脂耶氏酵母基因组中敲除磷脂酸磷酸酯酶和ras2位点，插入了细胞色素p450单加氧酶、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素p450还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶、法尼基焦磷酸合酶、柠檬酸转运蛋白、苹果酸酶和血红蛋白编码基因表达盒后得到的。

6、在本发明中，细胞色素p450单加氧酶、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素p450还原酶编码基因来源于灰葡萄孢霉(botrytis cinerea)，经密码子优化后所得；3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶、法尼基焦磷酸合酶和柠檬酸转运蛋白基因来源于解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)；苹果酸酶编码基因来源于卷枝毛霉(mucor circinelloides)，经密码子优化后所得；血红蛋白编码基因来源于透明颤菌，经密码子优化后所得。

7、在本发明中，所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子ptefin、ptef、pexp或pgpd中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子txpr2t、tmig1t、tcyc1t或tlip2t中的任意一种。

8、在本发明中，所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的a08位点、inta位点、scp位点、intc位点、pah1位点、inta3位点、intf位点、ras2位点、inte5位点中的任意一种。

9、在本发明中，所述细胞色素p450单加氧酶包括bcaba1和bcaba2，bcaba1、bcaba2、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素p450还原酶编码基因序列如seq id no：1-5所示，苹果酸酶编码基因序列如seq id no：6所示，血红蛋白(vhb)编码基因序列如seq id no：7所示。

10、本发明还提供所述高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，包括将磷脂酸磷酸酯酶敲除盒，ras2敲除盒，细胞色素p450单加氧酶表达盒，倍半萜合成酶表达盒，倍半萜脱氢酶表达盒，细胞色素p450还原酶表达盒，3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒，法尼基焦磷酸合酶表达盒，柠檬酸转运蛋白表达盒，苹果酸酶编码基因表达盒，血红蛋白编码基因表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。

11、在本发明中，所述解脂耶氏酵母敲除了ku70基因。

12、本发明还提供所述重组菌在生产脱落酸中的应用，包括采用发酵培养基培养权利要求1-5中任一所述重组菌，得到发酵产物的步骤。

13、在本发明中，所述发酵培养基含有葡萄糖70-180g/l，蛋白胨0.1-25g/l，酵母提取物2-12g/l。

14、有益效果：本发明高产脱落酸的解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)，是基于敲除了负责编码非同源重组基因ku70的解脂耶氏酵母，使其同源重组能力增强，通过解脂耶氏酵母自身的同源重组功能实现基因的整合，大幅度提高导入基因的遗传稳定性。该重组解脂耶氏酵母构建方法高效，操作简单。本发明高产脱落酸的解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)过表达了bcaba1、bcaba2、bcaba3、bcaba4和bccpr1，并通过不同强度启动子平衡脱落酸途径中的细胞色素单加氧酶(cyp：bcaba1、bcaba2)和还原酶(cpr：bccpr1)的表达水平，此外重组解脂耶氏酵母菌的构建还包括敲除磷脂酸磷酸酯酶(pah1)以调控内质网大小，过表达3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶(thmg1)和法尼基焦磷酸合酶(erg20)增加mva路径通量，过表达柠檬酸转运蛋白(yhm2)表达盒增加前体乙酰-coa，敲除ras2构建稳定的无菌丝菌株，过表达苹果酸酶编码基因(mce2)表达盒增加nadph的供应以及过表达血红蛋白(vhb)编码基因增强细胞对氧气的吸收能力，具体合成策略见图1。实验证明该重组解脂耶氏酵母能够高效发酵生产脱落酸，实现了脱落酸在解脂耶氏酵母中的高效合成。

技术特征：

1.一株高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于是在解脂耶氏酵母基因组中敲除磷脂酸磷酸酯酶和ras2位点，插入了细胞色素p450单加氧酶、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素p450还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶、法尼基焦磷酸合酶、柠檬酸转运蛋白、苹果酸酶和血红蛋白编码基因表达盒后得到的。

2.根据权利要求1所述高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于细胞色素p450单加氧酶、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素p450还原酶编码基因来源于灰葡萄孢霉（botrytis cinerea），经密码子优化后所得；3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶、法尼基焦磷酸合酶和柠檬酸转运蛋白基因来源于解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica）；苹果酸酶编码基因来源于卷枝毛霉（mucor circinelloides），经密码子优化后所得；血红蛋白编码基因来源于透明颤菌，经密码子优化后所得。

3.根据权利要求2所述高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述各表达盒的启动子为解脂耶氏酵母的启动子ptefin、ptef、pexp或pgpd中的任意一种；所述终止子为解脂耶氏酵母的终止子txpr2t、tmig1t 、tcyc1t或tlip2t中的任意一种。

4.根据权利要求3所述高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述表达盒的整合位点为解脂耶氏酵母的a08位点、inta位点、scp位点、intc位点、pah1位点、inta3位点、intf位点、ras2位点、inte5位点中的任意一种。

5.根据权利要求4所述高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于所述细胞色素p450单加氧酶包括bcaba1和bcaba2，bcaba1、bcaba2、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素p450还原酶编码基因序列如seq id no：1- 5所示，苹果酸酶编码基因序列如seq id no：6所示，血红蛋白（vhb）编码基因序列如seq id no：7所示。

6.权利要求1所述高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于包括将磷脂酸磷酸酯酶敲除盒，ras2敲除盒，细胞色素p450单加氧酶表达盒，倍半萜合成酶表达盒，倍半萜脱氢酶表达盒，细胞色素p450还原酶表达盒，3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶表达盒，法尼基焦磷酸合酶表达盒，柠檬酸转运蛋白表达盒，苹果酸酶编码基因表达盒，血红蛋白编码基因表达盒通过质粒形式导入所述解脂耶氏酵母，然后通过同源重组整合在解脂耶氏酵母基因组上的步骤。

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于所述解脂耶氏酵母敲除了ku70基因。

8.权利要求1-5中任一所述重组菌在生产脱落酸中的应用，其特征在于包括采用发酵培养基培养权利要求1-5中任一所述重组菌，得到发酵产物的步骤。

9.根据权利要求8所述重组菌在生产脱落酸中的应用，其特征在于所述发酵培养基含有葡萄糖70-180 g/l，蛋白胨0.1-25 g/l，酵母提取物2-12 g/l。

技术总结
本发明提供一株高产脱落酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用，属于生物工程领域。该重组解脂耶氏酵母菌，在解脂耶氏酵母基因组中敲除磷脂酸磷酸酯酶和RAS2位点，插入了细胞色素P450单加氧酶、倍半萜合成酶、倍半萜脱氢酶、细胞色素P450还原酶、3‑羟基‑3‑甲基戊二酰CoA还原酶、法尼基焦磷酸合酶、柠檬酸转运蛋白、苹果酸酶和血红蛋白编码基因表达盒后得到的。本发明重组解脂耶氏酵母菌能够高产脱落酸。

技术研发人员：纪晓俊,孙美莉,林璐,黄和
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/31