一种结肠癌肝转移的模型及其构建方法与流程

本发明属于生物医学，具体涉及一种结肠癌肝转移的模型及其构建方法。

背景技术：

1、结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，肝脏是结肠癌血行转移最主要的靶器官，有15％-25％的结肠癌患者在确诊时已发生肝转移，肝转移也是结肠癌患者最主要的死亡原因。传统研究肿瘤发生发展机制的方法包括2d培养和构建动物模型，但2d培养缺乏内部空间信息、细胞类型和肿瘤微环境的多样性。动物模型虽然广泛应用于肿瘤研究中，但仍存在一些基本限制，例如与人体组织环境和免疫系统缺乏相似性，普遍变异性、异种移植程序复杂及临床实验的成功率较低，需要较长的培养周期且成本较高等。

2、因此需要构建新型肿瘤模型用于研究临床前结肠癌肝转移的发生发展机制。三维生物打印是一种有前景的多功能技术，利用3d打印技术构建肿瘤模型可以提高模型的可重复性和标准化水平，并且清晰的模拟细胞与细胞之间，细胞与细胞基质之间的相互作用。常见的3d打印技术中，打印精度会严重影响模型的构建，如cn116836312a中公开的一种打印墨水中加入gelma和酚红进行打印，但打印产品界限不清晰且机械强度不够。传统用于生物模型构建的3d打印的打印墨水中包含多种成分，如胶原蛋白、聚己内酯、海藻酸钠、葡萄糖酸钙、明胶、光阻剂等，其配置过程复杂且打印产品的质量与多种因素相关，不适用于结肠癌肿瘤模型的构建。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种结肠癌肝转移的模型及其构建方法，所述的模型可体外模拟结肠癌细胞向肝脏转移的过程，并探究这一过程免疫细胞、癌细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞所起作用及如何影响组织微环境并最终影响结肠癌细胞的肝脏转移的。尤其是免疫细胞，例如巨噬细胞在结肠癌肝转移的过程中进一步促进肿瘤的生长和血管化，进而促进结肠癌向肝脏的转移。

2、本发明第一方面，提供了一种结肠癌肝转移的模型，所述的模型包括上层培养室和下层培养室，所述上层培养室培养的细胞包括结肠癌细胞和免疫细胞，所述下层培养室培养的细胞包括肝脏细胞，所述上层培养室与下层培养室通过孔(多个孔)连通。

3、优选的，连通上层培养室与下层培养室的多个孔可以实现上下两层之间的细胞或细胞外基质的交流和相互作用。

4、优选的，连通上层培养室与下层培养室的多个孔的孔径大小和形状可以根据不同的需求进行选择，常见的孔径大小包括0.4、3、5、8、12、24等。

5、优选的，所述的结肠癌细胞通过3d打印制备获得。

6、优选的，所述的结肠癌细胞选自人或非人动物的结肠癌细胞，进一步优选的，所述的人类结肠癌细胞系包括sw480、sw620、sw1116、hct116、hct-15、ht-29、dld-1或lovo中的一种或两种以上。

7、本发明的一个具体实施方式中，所述的结肠癌细胞为hct116细胞系。

8、优选的，所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞中的一种或两种以上。进一步优选的，所述的巨噬细胞包括m1促炎型巨噬细胞和m2抗炎型巨噬细胞，更进一步优选的，所述的巨噬细胞选自raw264.7、thp-1或j774a.1中的一种或两种以上。

9、本发明的一个具体实施方式中，所述的巨噬细胞为raw264.7。

10、优选的，所述的肝脏细胞选自肝细胞、肝星状细胞、肝胆管细胞、枯否细胞或肝血窦内皮细胞中的一种或两种以上。

11、本发明的一个具体实施方式中，所述的肝脏细胞为肝星状细胞。

12、优选的，所述模型培养的细胞还包括血管内皮细胞。

13、优选的，所述的血管内皮细胞选自连续型内皮细胞、断裂型内皮细胞、再生型内皮细胞或胆固醇型内皮细胞中的一种或两种以上。进一步优选的，所述的血管内皮细胞选自huvec、ecv304或crl-1730中的一种或两种以上。本发明的一个具体实施方式中，所述的血管内皮细胞为huvec。

14、优选的，所述的血管内皮细胞位于上层培养室和/或下层培养室。

15、优选的，所述的血管内皮细胞通过3d打印制备获得。

16、所述的模型为体外凝胶模型。

17、本发明的第二方面，提供了一种上述模型的构建方法，所述的构建方法包括将结肠癌细胞通过3d打印后与免疫细胞共培养置于模型的上层培养室。

18、优选的，将血管内皮细胞通过3d打印后与肝脏细胞置于模型的上层和/或下层培养室。

19、所述3d打印使用的打印墨水包含甲基丙烯酰化明胶和/或酚红；

20、优选的，所述的打印墨水中包含0.1％-30％的甲基丙烯酰化明胶，进一步优选的，所述的打印墨水中包含1％-20％的甲基丙烯酰化明胶，例如0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％；

21、优选的，所述的打印墨水中酚红的浓度为0.1-120μg/ml，进一步优选的，所述的打印墨水中酚红的浓度为1-100μg/ml，更进一步优选的，所述的打印墨水中酚红的浓度为20-60μg/ml，例如0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、120μg/ml。

22、所述的3d打印中单层打印时长为0.1-60s，优选的，所述的3d打印中单层打印时长为1-50s，例如0.1s、1s、5s、10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、60s。

23、所述的3d打印的温度为30℃-40℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。

24、本发明第三方面，提供了一种上述构建方法获得的结肠癌肝转移的模型。

25、本发明第四方面，提供了一种免疫细胞在制备结肠癌肝转移模型中的应用。

26、优选的，所述的免疫细胞包括淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞或肥大细胞中的一种或两种以上。进一步优选的，所述的巨噬细胞包括m1促炎型巨噬细胞和m2抗炎型巨噬细胞，更进一步优选的，所述的巨噬细胞选自raw264.7、thp-1或j774a.1中的一种或两种以上。

27、本发明的一个具体实施方式中，所述的巨噬细胞为raw264.7。

28、优选的，所述的结肠癌肝转移模型为上述第一或第三方面所述的模型或第二方面所述构建方法获得的模型。

29、优选的，所述的免疫细胞促进肿瘤的生长和血管化。

30、优选的，所述的免疫细胞促进结肠癌向肝转移。

31、本发明的第五方面，提供了一种上述的模型或构建方法获得的模型在筛选治疗结肠癌的药物及药效评价中的应用，或者在研究结肠癌发病机制中应用，或者在研究结肠癌肝脏转移的发病机制中的应用。

32、本发明第六方面，提供了一种打印墨水。

33、所述的打印墨水可用于制备结肠癌肝转移模型。

34、所述的打印墨水中包含结肠癌细胞、免疫细胞或肝脏细胞中的一种或两种以上。

35、所述的打印墨水中还包含血管内皮细胞。

36、所述的打印墨水中包含甲基丙烯酰化明胶和/或酚红。

37、优选的，所述的打印墨水中包含0.1％-30％的甲基丙烯酰化明胶，进一步优选的，所述的打印墨水中包含1％-20％的甲基丙烯酰化明胶，例如0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％；

38、优选的，所述的打印墨水中酚红的浓度为0.1-120μg/ml，进一步优选的，所述的打印墨水中酚红的浓度为1-100μg/ml，更进一步优选的，所述的打印墨水中酚红的浓度为20-60μg/ml，例如0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、120μg/ml。

39、本发明的一个具体实施方式中，所述的打印墨水中包含10％的甲基丙烯酰化明胶，所述的打印墨水中酚红的浓度为50μg/ml。

40、本发明的第七方面，提供了第六方面所述的打印墨水的应用，所述的应用包括：制备结肠癌肝转移模型或者在3d打印或者在打印结肠癌细胞和/或血管内皮细胞中的应用。

41、本发明采用3d打印技术，在体外构建出模块化仿生结直肠癌肝转移模型，通过体外培养模拟结直肠癌细胞向肝脏转移的过程，探究这一过程中的免疫细胞(肿瘤巨噬细胞)、癌细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞所起到的作用，以及各种细胞是如何影响组织微环境，并最终影响结直肠癌细胞的肝脏转移的。结果显示，本发明公开的一种结肠癌肝转移模型的构建方法操作简单，成功率高且用时短。本发明所构建的结肠癌肝转移模型为通过3d打印技术所实现的，模型结构与生理条件下的组织学特征更为相似，更有效的模拟了人体内结肠癌肝转移的过程，进一步的，本发明所构建的结肠癌肝转移模型可应用于研究结肠癌肝转移的发病机制及筛选治疗结肠癌的药物和药效评价。