一种转基因鼠源饲养型细胞系及其建立方法和应用与流程

本发明涉及杂交瘤，具体而言，涉及一种转基因鼠源饲养型细胞系及其建立方法和应用。

背景技术：

1、杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏b细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞。细胞融合后需要经选择性培养基和间接酶联免疫吸附试验(elisa)筛选获取能产生特异性抗体的阳性杂交瘤细胞，而得到单一阳性杂交瘤细胞需要经过多次的单克隆化，即亚克隆。

2、常用的亚克隆借助于有限稀释法，最终使一个96孔中有且仅有单个杂交瘤细胞。但是此时单个杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其它活细胞促进它繁殖，这种被加入的活细胞称之为饲养型细胞(feeder cells)。饲养型细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生的杂交瘤对细胞密度的依赖性。

3、常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞，其中小鼠的腹腔巨噬细胞使用最为广泛。但是，从小鼠腹腔获取原代细胞面临几个难以避免的弊端：1，操作过程存在技术上复杂的步骤，不同操作者取同一小鼠效果不同，甚至，同一操作者取不同小鼠效果也不相同；2，过程中容易因为操作不当造成污染；3，同时，取小鼠腹腔细胞需要处死大量小鼠，不符合当今动物福利的要求，也不经济环保。

4、鉴于以上原因，开发一种能表达生长刺激因子的细胞系以替代小鼠来源的原代细胞作为支撑杂交瘤细胞生长的饲养层具有重要的现实意义。

5、有鉴于此，特提出本技术。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种转基因鼠源饲养型细胞系及其建立方法和应用，通过基因编辑手段将编码鼠源白介素-6和表皮生长因子egf的基因导入鼠胚胎纤维细胞，首次构建了一种表达鼠源白介素-6和表皮生长因子egf的鼠胚胎纤维细胞，可作为饲养型细胞促进或维持单个杂交瘤细胞生长，可用但不局限于杂交瘤细胞的亚克隆过程。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、第一方面，本发明提供一种转基因鼠源饲养型细胞系，所述细胞系是经基因遗传修饰鼠胚胎纤维细胞以稳定持续性表达鼠源白介素-6和/或表皮生长因子egf的细胞系。

4、在某一具体实施方式中，所述白介素-6包含与seq id no:1具有至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列或与seq id no:3具有至少90％或至少95％序列同一性的核苷酸序列，所述表皮生长因子egf包含与seq id no:2具有至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列或与seq id no:4具有至少90％或至少95％序列同一性的核苷酸序列。具体的，seq id no:1：

5、mkflsardfhpvaflglmlvtttafptsqvrrgdftedttpnrpvyttsqvgglithvlweivemrkelcngnsdcmnnddalaennlklpeiqrndgcyqtgynqeicllkissglleyhsyleymknnlkdnkkdkarvlqrdtetlihifnqeiswshrrsg

6、seq id no:2：

7、mpwgrrptwlllafllvflkisilsvtansypgcpssydgyclnggvcmhiesldsytcncvigysgdrcqtrdlrwwelr

8、seq id no:3：

9、atgaagttcctgagcgcccgggacttccacccagtggcttttctgggcctgatgctggtgaccaccaccgctttccctacctcccaggtgaggaggggagacttcaccgaggacaccacccctaaccggccagtgtacaccacctcccaggtgggaggactgattacccacgtcctgtgggagattgtggagatgaggaaggagctgtgcaacggaaacagcgactgcatgaacaacgacgacgccctggctgagaacaacctgaagctgccagagattcagagaaacgatggctgttatcagaccggatacaaccaggagatttgtctgctgaagattagctccgggctgctggagtatcactcctatctggagtacatgaagaacaacctgaaagacaacaagaaggataaggccagggtgctgcaaagagacacagagactctgattcacatcttcaaccaggagattagctggagccacaggaggagcggc

10、seq id no:4：

11、atgccttggggtcgcagacctacatggctgctgttggccttcttgttggtgttcttgaagatcagcattctgtcagtgactgctaatagctaccctggatgtccaagcagctatgacggctactgcctgaacggaggcgtttgtatgcacatcgaaagcctggactcatacacctgcaactgcgtgatcggctacagcggagacagatgtcagacacgcgacctgaggtggtgggagcttagg

12、在某一具体实施方式中，所述基因遗传修饰采用慢病毒载体。

13、在某一具体实施方式中，所述慢病毒载体含人巨细胞病毒即时早期启动子，氨苄青霉素抗性基因和含人延伸因子ef-1α核心启动子的嘌呤霉素抗性基因。

14、第二方面，本发明还提供一种转基因鼠源饲养型细胞系的建立方法，包括如下步骤：

15、1)利用in-fusioncloning技术构建慢病毒载体，构建以人巨细胞病毒即时早期启动子(cmv)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)和含人延伸因子ef-1α核心启动子的嘌呤霉素抗性基因(plentipuro)的慢病毒载体为目的载体；

16、2)将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因克隆到pentr1a载体，生成tk-pcdh载体；

17、3)将t2a克隆进入位点，和绿色荧光蛋白基因同步克隆到tk-pcdh载体，生成tk-pcdh-copgfp-t2a-puro载体；

18、4)将编码鼠源白介素-6和表皮生长因子egf的基因序列合成并分别克隆到tk-pcdh-copgfp-t2a-puro载体上,生成表达目的基因片段的表达载体tk-pcdh-copgfp-t2a-puro-il6和载体tk-pcdh-copgfp-t2a-puro-egf；

19、5)将载体tk-pcdh-copgfp-t2a-puro-il6或载体tk-pcdh-copgfp-t2a-puro-egf与病毒包装辅助质粒pspax2、pmd2g同时转染到人肾上皮细胞系hek-293t细胞生成携带目的基因片段的成熟型慢病毒；

20、6)将携带tk-pcdh-copgfp-t2a-puro-il6或tk-pcdh-copgfp-t2a-puro-egf的成熟型慢病毒感染鼠胚胎纤维细胞系balb/3t3细胞，通过药物筛选，获得稳定表达鼠源白介素-6或表皮生长因子egf的balb/3t3细胞系，分别命名为balb/3t3il6细胞和balb/3t3egf细胞；

21、7)将构建的balb/3t3il6细胞和balb/3t3egf细胞分别置于含10％胎牛血清(fbs)和1％青链霉素的高糖基础培养基(dmem)中进行常规传代培养。

22、在某一具体实施方式中，步骤5)中药物筛选采用8ug/ml嘌呤霉素。

23、第三方面，本发明还提供转基因鼠源饲养型细胞系的应用，作为饲养细胞用于鼠源杂交瘤细胞的亚克隆过程。

24、在某一具体实施方式中，用于鼠源杂交瘤细胞的半固体法亚克隆过程或有限稀释法亚克隆过程。

25、在某一具体实施方式中，具体应用方法为：

26、将balb/3t3il6细胞和balb/3t3egf细胞按照2:8～8:2的数量比例预混合，用dmem培养基进行重悬，将鼠源杂交瘤细胞加入上述重悬混合细胞中，放入37℃，5％ co2的条件下培养。

27、在某一具体实施方式中，balb/3t3il6细胞和balb/3t3egf细胞的混合比例为7:3或6:4。

28、balb/3t3细胞是来源于balb/c小鼠背景，是一种胚胎成纤维细胞系，其克隆号为a31(clone-a31)。balb/3t3细胞具有明显的两个特征，其一，作为来源于balb/c小鼠背景的细胞系，balb/3t3细胞与杂交瘤细胞共培养时不会出现排异反应，从而稳定存在；其二，balb/3t3细胞生长速度缓慢，在杂交瘤细胞单克隆化过程中，不会存在过生长情况以保证杂交瘤细胞有充足营养生长。鉴于上述原因，本发明选择balb/3t3细胞作为宿主细胞进行基因工程化改造。

29、本发明通过基因编辑手段将编码鼠源白介素-6和表皮生长因子egf的基因导入鼠胚胎纤维细胞(balb/3t3)，并通过药物筛选获得稳定遗传表达鼠源白介素-6和表皮生长因子egf的细胞系，可以作为杂交瘤细胞单克隆化过程中的饲养型细胞。

30、由于细胞系在合适的培养环境中具有无限增殖能力，因此具备永生化特性，应用于杂交瘤细胞的单克隆化过程使用，将极大的减少实验动物的使用，并提高阳性杂交瘤发现的效率。

31、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

32、本发明实施例提供的一种转基因鼠源饲养型细胞系及其建立方法和应用，通过基因编辑手段将编码鼠源白介素-6和表皮生长因子egf的基因导入鼠胚胎纤维细胞，首次构建了一种表达鼠源白介素-6或表皮生长因子egf的鼠胚胎纤维细胞，可作为饲养型细胞促进或维持单个杂交瘤细胞生长，可用但不局限于杂交瘤细胞的亚克隆过程。