用于提取酵母细胞核的裂解液及提取方法

本发明涉及生物，尤其涉及用于提取酵母细胞核的裂解液及提取方法。

背景技术：

1、niepel,mario,et al等人于2017年发表的文章中公开了一种提取酿酒酵母细胞核的方法，该方法提取的细胞核虽然含有完整核膜结构，但并未关注核内染色体是否被降解。然而，经研究发现，利用其公开的方法提取的酵母细胞核仅能保证结构完整，其核内染色体dna全部降解。

2、目前，已报道的提取方法无法提取超过100kb的完整染色体，也无法在不使用交联剂固定的情况下，获得核内染色体dna不被降解、具有完整染色体、维持染色体高级结构的细胞核。因此提供一种能够保证细胞核结构完整性且避免染色体降解的提取试剂和提取方法具有重大意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了用于提取酵母细胞核的裂解液及提取方法。该裂解液提取得到的酵母细胞核具有完整的核膜结构且染色体dna未被降解。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种提取酵母细胞核的裂解液，其特征在于，包括pvp、edta、k+盐、蛋白酶抑制剂、dnase抑制剂、多胺类化合物和水；

4、所述多胺化合物包括精胺和亚精胺。

5、一些实施方案中，所述裂解液中，亚精胺的终浓度≥1mm，精胺的终浓度≥1mm。

6、一些实施方案中，所述裂解液包括水和如下终浓度的组分：

7、5-10％pvp-40，20mm k-phosphate，5-50mm edta，1-20mm精胺，1-50mm亚精胺，1-5vol％的dnase抑制剂，1-5vol％蛋白酶抑制剂，ph 6.5。

8、一些具体实施例中，所述裂解液包括水和如下终浓度的组分：

9、8wt％pvp-40，20mm k-phosphate，5mm edta，20mm精胺，1mm亚精胺，5vol％dnase抑制剂，1vol％蛋白酶抑制剂，ph 6.5；

10、或，8wt％pvp-40，20mm k-phosphate,50mm edta，1mm精胺，50mm亚精胺，1vol％dnase抑制剂、5vol％蛋白酶抑制剂，ph 6.5；

11、或8wt％pvp-40,20mm k-phosphate，10mm edta，2mm精胺，4mm亚精胺，2vol％dnase抑制剂，1vol％的蛋白酶抑制剂(ph 6.5)。

12、本发明中，dnase抑制剂为普通市售品。所述蛋白酶抑制剂为复方抑制剂，包括aebsf、抑肽酶、乌苯美司、e-64、亮抑酶肽、抑肽素a和pmsf。一些实施方案中，所述蛋白酶抑制剂中各组分在所述裂解液中的浓度分别为：104mmaebsf、80μm抑肽酶、4mm乌苯美司、1.4mm e-64、2mm亮抑酶肽和2～2.5mm抑肽素a。本发明对所述复方抑制剂的具体形式没有特殊要求，可直接购买包含上述成分的复方抑制剂，也可也可单独购买各组分后自行配制获得所述复方抑制剂，不管以何种形式添加到裂解液中，保证以上各组分在裂解液中的浓度在本发明保护范围内即可。

13、一些具体实施例中，所述裂解液中，抑肽素a的浓度具体可为2.0mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm。

14、本发明还提供一种提取酵母细胞核的试剂，包括本发明所述的裂解液和其他试剂成分；所述其他试剂成分选自重悬液、冻存液或蔗糖密度梯度离心所用的蔗糖溶液中的至少一种。

15、一些实施方案中，所述重悬液为含edta、精胺，亚精胺、dnase抑制剂、蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液，所述重悬液中蔗糖的浓度≥1.5m；

16、所述冻存液为含5-50mm edta、1-20mm精胺、1-50mm亚精胺、1-5vol％的dnase抑制剂、1-5vol％的蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液，所述冻存液中蔗糖的浓度≥1.875m；

17、所述蔗糖密度梯度离心所用的蔗糖溶液为含5-50mm edta、1-20mm精胺、1-50mm亚精胺、1-5vol％的dnase抑制剂、1-5vol％的蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液；所述蔗糖的浓度选自1.5～2.5m；

18、所述重悬液、冻存液或蔗糖密度梯度离心所用的蔗糖溶液中，所述蛋白酶抑制剂为复方抑制剂，所述复方抑制剂中各组分的浓度为：104mmaebsf、80μm抑肽酶、4mm乌苯美司、1.4mm e-64、2mm亮抑酶肽和2～2.5mm抑肽素a和115mm pmsf。

19、一些具体实施例中，所述重悬液、冻存液或蔗糖密度梯度离心所用的蔗糖溶液中，抑肽素a的浓度具体可为2.0mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm。

20、本发明还提供了所述裂解液或所述试剂在提取酵母细胞核中的应用。

21、本发明对酵母的具体类型没有特殊限制，本领域常见的酵母类型，如芽殖酵母、裂殖酵母、毕赤酵母等，利用本发明裂解液或试剂进行提取均可实现相似的提取效果。

22、本发明还提供了酵母细胞核的提取方法，包括：利用本发明所述的裂解液对酵母细胞进行提取。

23、一些实施方案中，所述提取方法具体包括：

24、a)将酵母培养或处理至对数期，去除细胞壁，获得原生质体；

25、b)利用权利要求1～3任一项所述的裂解液重悬所述原生质体，获得原生质体悬液；

26、c)将所述原生质体悬液依次进行匀浆、蔗糖密度梯度离心，收集中间层；再次离心、重悬，获得纯化后的酵母细胞核溶液；

27、一些实施方案中，步骤a)中，利用zymolyase和dtt去除细胞壁。

28、一些实施方案中，步骤b)中，所述重悬之前还包括利：依次使用山梨醇、7.5％ficoll溶液洗涤原生质体的步骤。

29、一些实施方案中，步骤c)中，所述蔗糖梯度密度离心包括第一离心和第二离心，在所述第一离心后，收集中间层加入0.6m蔗糖溶液稀释后，进行第二离心；

30、所述第一离心的条件为：离心力不低于100000g，离心时间不少于15分钟，所述蔗糖密度梯度使用的蔗糖浓度的浓度包括2.5m和1.875m；

31、所述第二离心的条件为：离心力不低于200000g，离心时间不少于15分钟，所述蔗糖密度梯度使用的蔗糖浓度的浓度包括2.5m和1.5m。

32、一些实施方案中，步骤c)中，所述再次离心之前还包括加入0.6m蔗糖溶液稀释的步骤，所述再离心的条件为：20000g离心至少10分钟。

33、一些实施方案中，步骤c)中，所述重悬用的溶液为浓度≥1.5m蔗糖溶液，一些具体实施例中，所述蔗糖溶液的浓度为1.5m。

34、本发明步骤(c)中，包括蔗糖梯度密度离心、重悬、稀释等步骤，所使用的蔗糖溶液均为含edta、精胺，亚精胺、dnase抑制剂、蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液。一些实施方案中，所述蔗糖溶液为含5-50mm edta、1-20mm精胺、1-50mm亚精胺、1-5vol％的dnase抑制剂、1-5vol％的蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液。一些具体实施例中，所述蔗糖溶液为含5mm edta、20mm精胺、1mm亚精胺、5vol％dnase抑制剂和1vol％蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液，或为含10mmedta，2mm精胺，4mm亚精胺，2wt％dnase抑制剂，1wt％的蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液。

35、经测定，采用本发明裂解液及提取方法获得的酵母细胞核的粒径≤1μm，而现有方法提取获得的细胞核的粒径为2μm左右，相比现有方法，本发明提取获得的细胞核粒径更小，细胞膜完整，核内染色体dna没有被降解且维持染色体高级结构，更利于递送到哺乳动物细胞，且适用于将核内外源大dna递送到动物细胞中。

36、本发明中，蔗糖梯度密度离心、重悬、稀释、冻存等步骤所使用的蔗糖溶液中，蛋白酶抑制剂为复方抑制剂，具体组成与裂解液中的蛋白酶抑制剂组成相同，在此不做赘述。

37、一些实施方案中，本发明提取方法还包括利用冻存液对提取获得的酵母细胞核进行冻存的步骤，所述冻存液为含edta、精胺，亚精胺、dnase抑制剂、蛋白酶抑制剂的蔗糖溶液，所述冻存液中蔗糖的浓度≥1.875m；所述冻存液中的蛋白酶抑制剂为复方抑制剂，具体组成与裂解液中的蛋白酶抑制剂组成相同，在此不做赘述。

38、本发明提供一种提取酵母细胞核的裂解液，包括pvp、edta、k+盐、蛋白酶抑制剂、dnase抑制剂和多胺类化合物；所述多胺化合物包括精胺和亚精胺。实验结果表明，本发明裂解液及提取方法能够在体外分离出高纯度的酿酒酵母细胞核，核内染色体dna没有被降解、且核内的染色体仍维持了高级结构。