一种乳酸菌素非致病性杂菌检查方法及其应用与流程

本发明涉及微生物检测，特别涉及一种乳酸菌素非致病性杂菌检查方法及其应用。

背景技术：

1、乳酸菌素是乳酸菌在代谢过程中所产生的一种杀菌蛋白或多肽，经乳酸菌发酵冻干后制成粉末。根据乳酸菌素用途，目前市面上已出现多种乳酸菌素类制剂，包括乳酸菌素片、乳酸菌素分散片、乳酸菌素颗粒等。近年来，随着人们对乳酸菌的进一步研究，乳酸菌素在妇科用药方面也有新的用途，可用于由菌群紊乱而引起的细菌性阴道病的治疗，据临床观察，其效果显著。

2、乳酸菌素作为一种微生态活菌制品的主要活性成分之一，为避免其在生产过程中引入来自于水系统、辅料、设备、人员和环境等污染，故需对其微生物污染情况进行控制。微生态活菌制品杂菌检查是微生态活菌制品质量研究的关键指标，直接关系到上市药品的质量及安全性。杂菌检查法系检查原料、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。检查项目包括控制菌检查，非致病性杂菌、真菌计数。故可采用微生态活菌制品杂菌检查法对乳酸菌素的微生物污染情况进行检查。

3、乳酸菌素具有抑菌作用，抑菌试验表明，它不仅对革兰氏阳性细菌有抑制性，对革兰氏阴性细菌也有不同程度的抑制作用。因非致病性杂菌数检查方法适用性试验时需进行试验菌回收试验，鉴于乳酸菌素具有抑菌作用，因此乳酸菌素非致病性杂菌数检查方法具有一定难度，无法直接采用《中国药典》2020版三部微生态活菌制品总论通用方法，且目前未见文献报道其检查方法。因此，开发一种乳酸菌素的非致病性杂菌数检查方法，对其质量控制具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、鉴于以上现有技术中存在的缺陷，本发明的目的旨在提供一种乳酸菌素非致病性杂菌检查方法及其应用，以解决现有技术中的问题。

2、第一方面，为实现上述目的，本发明提供一种乳酸菌素非致病性杂菌检查方法，检测步骤中使用胰蛋白酶。

3、本发明提供的乳酸菌素非致病性杂菌检查方法，包括以下步骤：

4、s1.取待测含乳酸菌素的样品适量，将其稀释获得含有乳酸菌素的稀释液；

5、s2.向步骤s1所述含有乳酸菌素的稀释液中加入胰蛋白酶获得混合液；

6、s3.将步骤s2所述混合液培养一定时间，进行菌落计数。

7、本发明的一些实施方式中，所述步骤s2中，加入胰蛋白酶获得混合液，胰蛋白酶在混合液中的终浓度为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml；优选地，所述胰蛋白酶的终浓度为0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml或2mg/ml。

8、本发明的一些实施方式中，所述步骤s1中含有乳酸菌素的稀释液的ph为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5；优选地，所述步骤s1中稀释液的ph为5.5～8.5；优选地，所述步骤s1中稀释液的ph为6.0～8.0；更优选地，所述步骤s1中稀释液的ph为6.5～7.8。

9、本发明的一些实施方式中，所述步骤s1中，含有乳酸菌素的稀释液中乳酸菌素的含量为质量体积比0.1％m/v、0.2％m/v、0.3％m/v、0.4％m/v、0.5％m/v、0.6％m/v、0.7％m/v、0.8％m/v、0.9％m/v、1.0％m/v、1.5％m/v、2.0％m/v、4.0％m/v、6.0％m/v、8.0％m/v、10.0％m/v、15.0％m/v、20.0％m/v、25.0％m/v或30.0％m/v。

10、本发明的一些实施方式中，所述步骤s3中，菌落计数方法的指标菌株为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、杆菌枯草芽孢杆菌中的一种或多种。

11、本发明的一些实施方式中，所述步骤s3中，菌落计数方法为涂布法或倾注法。

12、本发明的一些实施方式中，所述步骤s1中，采用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、无菌磷酸盐缓冲液中一种或多种稀释乳酸菌素，进一步地，所述聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为5％聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

13、本发明的一些实施方式中，所述步骤s3混合培养的培养基为营养琼脂培养基，或其他金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌或枯草芽孢杆菌能正常生长的培养基。

14、本发明的一些实施方式中，待测含乳酸菌素的样品为液态、固态或粉末，待测含乳酸菌素的样品为与其他一种或多种物质混合的混合物或不与其他物质混合的单品。优选地，在本发明一些具体实施方式中，待测乳酸菌素样品为无菌的，系脱脂牛乳经嗜酸乳杆菌发酵制成的粉末。

15、在本发明一些具体实施方式中，为制备含杂菌乳酸菌素待测样品或有污染的乳酸菌素待测样品，在无菌乳酸菌素中添加杂菌(试验菌株、指标菌株)以验证本发明提供的乳酸菌素非致病检测方法的检测能力。根据《中国药典》2020版三部微生态活菌制品总论附录3微生态活菌制品杂菌检查法的要求，所添加的杂菌(试验菌株、指标菌株)为《中国药典》推荐使用的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌。

16、进一步地，本发明所述乳酸菌素非致病性杂菌检查方法的开发试验组别含有：试验组、供试品对照组、菌液对照组、阴性对照组。

17、为控制单一变量，本发明同一具体实施例中，试验组与菌液对照组中添加的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌菌液浓度分别对应相同。

18、进一步地，本发明中药典与《中国药典》同义，本发明中《中国药典》方法、《药典》方法、药典通用方法、药典方法与《中国药典》通用方法同义。

19、进一步地，本发明步骤s3菌落计数按照公式计算回收值：回收＝(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数。《中国药典》回收标准为：试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

20、第二方面，本发明提供了本发明的乳酸菌素非致病性杂菌检查方法在含有乳酸菌素的食品或微生态制剂领域中应用。

21、第三方面，本发明提供了本发明的乳酸菌素非致病性杂菌检查方法在妇科阴道用药方面应用。

22、第四方面，本发明提供了本发明的乳酸菌素非致病性杂菌检查方法在阴道微生态制剂领域中应用。

23、与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

24、由于乳酸菌素具有抑菌效果，直接采用《中国药典》方法进行非致病性杂菌检查，不能满足回收条件，不能检查到乳酸菌素中含有多少菌，另外未见公开文献报道添加胰蛋白酶进行乳酸菌素非致病性杂菌检查，本发明在含有乳酸菌素的待测样品中开创性地加入胰蛋白酶，消除乳酸菌素抑菌性质对非致病性杂菌检出能力的干扰，同时乳酸菌素中的杂菌能够正常生长，达到正确检查乳酸菌素中杂菌数的目的。本发明提供的乳酸菌素非致病性杂菌检查方法简便、准确、效率高。