一种基于VIGS的沉默葡萄基因的方法与流程

本发明涉及生物，特别涉及基于vigs的葡萄基因沉默方法。

背景技术：

1、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，vigs)最早用来描述植物受病毒侵染后的症状恢复现象(van kammen，1997)。1999年，baulcombe发现vigs可以降解特定基因的转录，来下调该基因的表达量，因此认为vigs在研究基因功能领域中潜力巨大。2004年，burch-smith通过使用重组病毒来沉默植物内源基因，首次成功建立了vigs体系，此后被广泛应用。vigs技术不需要稳定遗传转化或获取突变体，不受遗传背景限制，具有操作简单、速度快、成本低、效率高、高通量等优势。目前，vigs技术已在多种植物中应用，如拟南芥、本氏烟草、番茄等。

2、葡萄有着8000多年的栽培历史，因其对不同环境的适应性较强而在世界范围内有着广泛的种植。葡萄果实可以用于鲜食，酿酒，制汁和制干，深受消费者的喜爱，因此具有重要的经济价值以及社会价值。

3、以烟草脆裂病毒改造的trv载体为基础的vigs体系是最常用的沉默工具，在棉花、番茄、拟南芥等物种中有较高的沉默效率。但由于葡萄为多年生藤本作物，其特有的生理结构特点导致vigs技术在葡萄中的应用受到限制。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何沉默葡萄基因。

2、针对目前vigs技术在葡萄中的应用受到限制现状，本发明的目的是提供一种基于vigs的沉默葡萄基因的方法。

3、本发明提供的一种基于vigs的沉默葡萄基因的方法，所述方法包括以vigs载体侵染葡萄幼苗上的子叶，得到侵染后的葡萄幼苗，培养所述侵染后的葡萄幼苗，得到基因沉默的葡萄植株；所述vigs载体是基于烟草脆裂病毒(trv)构建的载体，所述vigs载体由ptrv2-特异片段载体和ptrv1载体组成，所述ptrv2-特异片段载体是含有目的基因特异性片段和烟草脆裂病毒的病毒外壳蛋白编码基因的重组载体，所述ptrv1载体是含有rna依赖的rna聚合酶(rdrp)的载体。

4、上述方法中，所述葡萄幼苗为葡萄种子萌发后2-3周子叶完全展平的葡萄幼苗。

5、上述方法中，所述侵染包括将所述ptrv2-特异片段载体导入根癌农杆菌得到重组根癌农杆菌2，将所述ptrv1载体导入根癌农杆菌得到重组根癌农杆菌1，将含有所述重组根癌农杆菌2和重组根癌农杆菌1的侵染液以注射器针筒将所述侵染液注入葡萄幼苗上的子叶中。

6、上述方法中，所述农杆菌侵染液中所述重组根癌农杆菌2和所述重组根癌农杆菌1的摩尔比为1:1。

7、上述方法中，所述培养为先暗培养处理24h后再正常培养。

8、上述方法中，所述培养在22-28℃的温度下进行，优选为25℃。

9、上述方法中，所述正常培养可为每天16小时光照培养，8小时黑暗培养。

10、上述方法中，所述正常培养持续20–30天。

11、本发明以葡萄幼苗为材料，利用农杆菌介导侵染其子叶，培养侵染后的葡萄幼苗，得到基因沉默的葡萄植株。本发明所述沉默载体或沉默体系能够有效降低葡萄中目的基因(如vvpds基因)的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默植株，验证葡萄中目的基因功能。本发明的实施例中首次利用活体葡萄子叶作为vigs系统侵染对象，将含有vvpds基因特异性片段的ptrv2病毒沉默表达载体ptrv2-vvpds3转化到农杆菌体内，将含有ptrv1的农杆菌菌液和含有ptrv2-vvpds3的农杆菌菌液混合，得到沉默体系(即农杆菌菌液混合液)，采用侵染葡萄幼苗子叶的方法，诱导葡萄叶片内源vvpds基因发生沉默，有效降低了葡萄vvpds基因的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默表型，能够验证葡萄vvpds基因功能，在葡萄的叶子相关功能基因的研究中具有应用价值。与常规侵染真叶相比，本发明所提供的方案操作简单，沉默效率高，稳定性好，为葡萄基因功能验证提供了技术支撑。

技术特征：

1.一种基于vigs的沉默葡萄基因的方法，其特征在于：所述方法包括以vigs载体侵染葡萄幼苗上的子叶，得到侵染后的葡萄幼苗，培养所述侵染后的葡萄幼苗，得到基因沉默的葡萄植株；所述vigs载体是基于烟草脆裂病毒构建的载体，所述vigs载体由ptrv2-特异片段载体和ptrv1载体组成，所述ptrv2-特异片段载体是含有目的基因特异性片段和烟草脆裂病毒病毒外壳蛋白编码基因的重组载体，所述ptrv1载体是含有rna依赖的rna聚合酶的载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄幼苗为葡萄种子萌发后2-3周子叶完全展平的葡萄幼苗。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述侵染包括将所述ptrv2-特异片段载体导入根癌农杆菌得到重组根癌农杆菌2，将所述ptrv1载体导入根癌农杆菌得到重组根癌农杆菌1，将含有所述重组根癌农杆菌2和重组根癌农杆菌1的侵染液以注射器针筒将所述侵染液注入葡萄幼苗上的子叶中。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养为先暗培养处理24h后再正常培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养在温度为22-28℃的环境中进行。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述22-28℃为25℃。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述正常培养持续20–30天。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，公开了一种基于VIGS的沉默葡萄基因的方法包括以VIGS载体侵染葡萄幼苗上的子叶，得到侵染后的葡萄幼苗，培养所述侵染后的葡萄幼苗，得到基因沉默的葡萄植株。本发明首次利用活体葡萄子叶作为VIGS系统侵染对象，诱导葡萄叶片内源VvPDS基因发生沉默，有效降低了葡萄VvPDS基因的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默表型，能够验证葡萄VvPDS基因功能。与常规侵染离体真叶相比，本发明所提供的方案操作简单，沉默效率高，稳定性好，为葡萄基因功能验证提供了技术支撑。

技术研发人员：魏彦锋,刘其宝,李廷刚,尹向田,袁丽芳,蒋锡龙,韩星,王春栋
受保护的技术使用者：山东省葡萄研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5