一种检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法

本发明涉及生物检测，更具体的说是涉及一种检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法。

背景技术：

1、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae，俗称肺炎杆菌，k.pneumoniale)是社区获得性感染和医院获得性感染常见的致病菌，由于其具有很厚的夹膜多糖，可有效地抑制中性粒细胞吞噬及抗生素的作用，从而更容易导致肺炎、血流感染及尿路感染等。随着荚膜多糖种类的差异、细菌毒力的变迁及抗生素的滥用，肺炎克雷伯菌的基因组已通过获得质粒和可转移的遗传元件(movablegeneelement，mge)获得耐药基因，导致多重耐药(multidrug-resistant，mdr)菌株和泛耐药(extremelydrug-resistant，xdr)菌株的出现，使得肺炎克雷伯菌高毒力耐药株引起的感染已经成为了一种世界性感染疾病。

2、传统检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法包括菌落形态、拉丝试验、线虫试验、中性粒细胞抗吞噬试验、血清抗性试验以及针对耐药性检测的药敏试验等，但这些方法不仅耗时较长，检测灵敏度比较低而且特异性不强，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难通过生理生化的方式加以区分。因此，目前普遍还是采用传统pcr方法检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌，但传统pcr方法所需的设备昂贵，步骤复杂，对人员要求高，不易大面积推广。

3、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种新型的、恒温条件下的核酸体外扩增技术，具有等温、快速、高特异性和灵敏度、产物检测简便等特点。但是，lamp检测方法多数以聚合反应的双链dna产物或其副产物为基础，只能判断有无扩增反应发生，而难以识别多重扩增产物的靶标来源及其特异性，导致容易出现假阳性。

4、另外，在实际检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌时，由于基质复杂，同时可能存在其它菌的干扰，很难对高毒力耐药肺炎克雷伯菌进行高灵敏、高特异性的检测。因此，提供一种特异性强、灵敏度高的检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供了一种检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法，具体步骤为目标菌的分离、核酸提取、环介导等温扩增和数据分析。

2、为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了用于检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的多重lamp引物组，由毒力peg-344基因引物组和耐药kpc-2基因引物组构成，所述基因引物组均包括：外引物f3/b3、内引物bip/fip以及环引物lf/lb；

3、其中，单增peg-344基因引物组的序列如seq id no.1～seq id no.6所示：

4、seq id no.1 f3：tggggttattctttcgct

5、seq id no.2 b3：tttccaagcttactgcaatt

6、seq id no.3 fip：ccagcaaaacagcctaaatacattgtggggagtatctttgagagg

7、seq id no.4 bip：ttgggatactgtgctatttttctctgggaagatgagaaatacgagc

8、seq id no.5 lf：gcagaaaagggctagcgc

9、seq id no.6 lb：cgcctccgtgatgaggatg

10、单增kpc-2基因的检测引物组的序列如seq id no.7～seq id no.11所示：

11、seq id no.7 f3：tggcttttctgccaccg

12、seq id no.8 b3：tgcgagccagcacagc

13、seq id no.9 fip：tacacaccgatggagccgcc-cctcgtcgcggaaccat

14、seq id no.10 bip：ggctcaggcgcaactgtaagt-gcagcaagaaagcccttgaa

15、seq id no.11 lb：aagtcctgttcgagtttagcga。

16、第二方面，本发明提供了一种检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法，可以用于检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌污染的食品、土壤及人和动物的血液、脑脊液等复杂基质的样品。

17、检测方法包括如下步骤：

18、(1)富集肺炎克雷伯菌：向样品溶液中加入生物素化抗体吹打混匀，摇床孵育；加入免疫磁珠，继续孵育，分离，清洗，重悬，即得富集肺炎克雷伯菌的复合物；

19、(2)提取富集肺炎克雷伯菌核酸；

20、(3)环介导等温扩增：

21、采用本发明所述的多重lamp引物组，对肺炎克雷伯菌核酸进行多重lamp反应；

22、(4)数据分析：在自然光下，观察lamp反应后溶液的荧光颜色；

23、若为黄绿色，则样品溶液中含有高毒力肺炎克雷伯菌；

24、若为天蓝色，则样品溶液中含有耐药肺炎克雷伯菌；

25、若为绿色，则样品溶液中含有高毒力耐药肺炎克雷伯菌。

26、优选地，步骤(1)所述样品溶液、所述生物素化抗体与所述免疫磁珠的体积比为100μl：60μl：100μl；

27、所述生物素化抗体为在抗体上连接生物素；

28、其中，抗体为肺炎克雷伯菌特异性的多克隆抗体。

29、优选地，步骤(1)所述免疫磁珠为链霉亲和素包被的磁性纳米粒子形成的复合物，具体包括：

30、11)洗涤磁性纳米粒子：

31、在外加磁场的作用下，用无菌的pbs溶液对磁性纳米粒子洗涤，重复3次，后重悬于无菌的pbs溶液中；

32、12)活化磁性纳米粒子：

33、分别将乙基二甲氨基碳化二亚胺和n-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于无菌的pbs溶液中，再将两种溶液加入至洗涤过的磁性纳米粒子溶液中进行活化；

34、活化后的磁性纳米粒子洗涤多次，重悬于溶液中；

35、13)制备链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物：

36、将链霉亲和素加入到活化后的磁性纳米粒子重悬液中，室温偶联，分离，多次洗涤后重悬于溶液中，得到链霉亲和素-磁性纳米粒子复合物。

37、优选地，所述磁性纳米粒子的平均粒径为180nm，表面连有羧基；

38、所述链霉亲和素为包含能与生物素结合的色氨酸残基的偏酸性蛋白质，其分子量为66kda。

39、优选地，所述洗涤及重悬所用溶液均为所述无菌的pbs溶液，浓度为0.01m，ph7.4。

40、优选地，所述磁性纳米粒子、所述乙基二甲氨基碳化二亚胺、所述n-羟基硫代琥珀酰亚胺和所述链霉亲和素的配比关系为：1ml：2.9mg：3.25mg：800μg。

41、优选地，步骤(3)所述lamp反应体系为：10.5μllamp混合液，4.4μl引物混合物，模板1μl，10×sybrgreeni染料1μl，超纯水补至25μl；

42、反应程序为：63℃，45min，85℃灭活5min。

43、优选地，所述的lamp混合液为：10×thermopol反应缓冲液2.5μl，100mm mgso41.5μl，5mmbetaine2μl，10mmdntp3.5μl，8000u/mlbstdna聚合酶1μl；

44、优选地，所述的引物混合为：

45、peg-344基因引物组：25μmfip/bip引物各0.8μl，25μmf3/b3引物各0.1μl，25μmlf/lb引物各0.2μl；

46、kpc-2基因引物组：25μmfip/bip引物各0.8μl，25μmf3/b3引物各0.1μl，25μmlb引物0.2μl。

47、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种捕获效率高、快速富集目的菌并进行特异性检测高毒力耐药肺炎克雷伯菌的方法，具有以下有益效果：

48、现有检测方法基于获得病原体后进行检测，费时费力、敏感性低、无法在样本中直接检测，为了避开增菌培养耗时长的短板，有效提高检测效率，我们提出通过磁分离技术直接捕获标本中的病原菌。在富集目标菌方面，现有技术中，免疫磁珠常用直接修饰的方式将抗体通过共价键与纳米磁珠的氨基、羧基等基团结合直接偶联于磁性纳米材料表面，进而靶向富集细菌，但这种修饰存在抗体定向不当、限制抗体的位点空间造成抗体修饰的纳米颗粒与病原体之间的结合效率低下，导致捕获效率低的不足，因此，本发明制备了链霉亲和素包被的磁性纳米粒子复合物，利用生物素化抗体通过生物素与链霉亲和素的色氨酸残基有机结合，然后抗体与肺炎克雷伯菌表面的特异性抗原相结合，消除了基质及常见菌的干扰，分离效率高，富集时间短；而且与抗体直接偶联纳米磁珠相比，间接法在复合物的合成过程中更节省抗体，降低了成本，耗时更短，缩短了整体的检测时间。

49、在基因检测方面，本发明针对高毒力耐药肺炎克雷伯菌的毒力基因peg-344和耐药基因kpc-2设计了特异性引物组，通过优化反应体系，进行多lamp反应，操作简便，可在63℃45min内出结果，可直接通过荧光观察，不仅结果判定简单，还克服了lamp检测易出现假阳性的缺点，实现了高灵敏、特异性检测出高毒力耐药肺炎克雷伯菌目的。此外，本发明的高毒力耐药肺炎克雷伯菌多重lamp反应体系对基因组的最低检测限是2.5cfu/ml，比传统pcr方法灵敏性高100倍，不仅降低了最低检测限还将检测时间缩短至2h以内。

50、本发明方法可对高毒力耐药肺炎克雷伯菌进行快速检测，解决了困扰已久的引物间相互干扰或配对引起非特异性扩增反应而导致假阳性的问题，实现了在多重扩增条件下保持对每一靶标较高的检测灵敏度。可在基层医疗单位进一步推广，也可作为基层防疫部门对饮食业环境以及食品安全监测的快速初筛试验及野外土壤等物质是否含有肺炎克雷伯杆菌的检测，在流行病学上有重要意义。