一种醋酸泼尼松的制备方法与流程

本发明涉及微生物制药及医药化工，尤其涉及一种醋酸泼尼松的制备方法。

背景技术：

1、甾体类药物是仅次于抗生素的世界第二大类药物，不同甾体药物均由甾体激素中间体衍生而来。甾体激素具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，主要用于严重细菌感染、急性淋巴白血病、风湿病、红斑狼疮、细胞性脑炎、皮肤病、抗肿瘤和抢救危重病人的重要用药。

2、醋酸泼尼松(分子式c23h28o6，化学名为：17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮-21-醋酸酯)白色或几乎白色结晶性粉末，无臭，味苦；不溶于水，微溶于甲醇、醋酸乙酯，略溶于丙酮，易溶于氯仿。醋酸泼尼松是一类重要的肾上腺皮质激素类药，适用于各种急性严重细菌感染，严重过敏性疾病，胶原性疾病(红斑狼疮、结节性动脉周围炎等)，风湿病、类风湿性关节炎、肾病综合征，严重支气管哮喘、血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、急性淋巴性白血病、各种肾上腺皮质功能不全症、剥脱性皮炎、天疱疮、神经性皮炎、湿疹等。

3、专利号为cn111485011a的发明专利公开了一种醋酸泼尼松的合成方法，该方法需要额外添加黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)外源性的辅酶作为氢受体，来破碎细胞，释放大量蛋白，提高产物的收率；且该方法所用的酶转化率低，24h转化率仅为81.2％。为此需要一种无需额外添加fad且转化醋酸泼尼松效率高的方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种无需fad，且转化率高的制备醋酸泼尼松生产方法。

2、本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种醋酸泼尼松的制备方法，包括如下步骤：

3、s1，扩增谷胱甘肽硫转移酶蛋白基因和3-甾酮-δ1-脱氢酶kstd基因，得到核苷酸序列如seq id no.1所示的gts-kstd融合蛋白；

4、s2，构建pet28a-gts-kstd质粒，并将其转化至大肠杆菌bl21中，获得重组菌；重组菌发酵培养，离心后得到重组菌菌泥；

5、s3，醋酸可的松乳化后，加入pms和步骤s2的重组菌菌泥，转化16-24h得到醋酸泼尼松。

6、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s3中所述醋酸可的松：重组菌菌体的质量比为(1-3)：1。

7、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s3中转化反应条件为：25-35℃，200-400r/min，通气量0.3-0.8vvm，压力0.01-0.1mpa。

8、在以上技术方案的基础上，优选的，重组菌发酵培养的方法为：重组菌二级培养后接种于含有卡那霉素的发酵培养基中，在35-37℃、600-800r/min、通气量2-3vvm条件下发酵培养，当do值达到50％-60％时添加补料培养基、培养至菌液od600值30-80时，加入iptg诱导表达12-18h后离心，获得发酵重组菌；转化反应时加入发酵重组菌菌体。

9、在以上技术方案的基础上，优选的，所述iptg的终浓度为0.5-1.0mmol/l。

10、在以上技术方案的基础上，优选的，加入iptg和甘氨酸共同诱导12-18h。

11、在以上技术方案的基础上，优选的，甘氨酸的终浓度为0.3-0.5mmol/l。

12、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s3中，步骤s3中，将醋酸可的松乳化时加入助溶剂，并在8000-12000r/min条件下匀浆10-15min得到乳化后醋酸可的松。

13、在以上技术方案的基础上，优选的，所述助溶剂为吐温80、甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜中的一种或多种组合。

14、在以上技术方案的基础上，优选的，所述助溶剂的体积浓度为1％-10％。

15、本发明的一种醋酸泼尼松的制备方法相对于现有技术具有以下有益效果：

16、(1)本发明将谷胱甘肽硫转移酶(gts)蛋白基因与3-甾酮-δ1-脱氢酶kstd进行融合表达，得到的重组脱氢酶，可利用细胞本身的fad辅酶再生体系，无需添加外源性的辅酶fad；此外gts蛋白提高了3-甾酮-δ1-脱氢酶在大肠杆菌bl21中的溶解性，以及3-甾酮-δ1-脱氢酶在大肠杆菌bl21中的蛋白表达量，同时也提高了3-甾酮-δ1-脱氢酶kstd转化醋酸泼尼松的效率。

17、(2)本发明在诱导表达时添加甘氨酸，可有效提高3-甾酮-δ1-脱氢酶在大肠杆菌bl21中的蛋白表达量，提高3-甾酮-δ1-脱氢酶kstd转化醋酸泼尼松的效率。(3)本发明在醋酸可的松乳化时加入助溶剂，可以提高醋酸泼尼松的转化效率，其中助溶剂对醋酸泼尼松转化率促进效果为甲醇＞乙醇＞丙酮＞吐温80＞dmso。

技术特征：

1.一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：步骤s3中所述醋酸可的松：重组菌菌体的质量比为(1-3)：1。

3.如权利要求1所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：步骤s3中转化反应条件为：25-35℃，200-400r/min，通气量0.3-0.8vvm，压力0.01-0.1mpa。

4.如权利要求1所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：步骤s2中重组菌发酵培养方法为：重组菌二级培养后接种于含有卡那霉素的发酵培养基中，在35-37℃、600-800r/min、通气量2-3vvm条件下发酵培养，当do值达到50％-60％时添加补料培养基、培养至菌液od600值30-80时，加入iptg诱导表达12-18h后离心，获得发酵重组菌；转化反应时加入发酵重组菌菌体。

5.如权利要求4所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：所述iptg的终浓度为0.5-1.0mmol/l。

6.如权利要求4所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：加入iptg和甘氨酸共同诱导12-18h。

7.如权利要求6所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：甘氨酸的终浓度为0.3-0.5mmol/l。

8.如权利要求1所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：步骤s3中，将醋酸可的松乳化时加入助溶剂，并在8000-12000r/min条件下匀浆10-15min得到乳化后醋酸可的松。

9.如权利要求8所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：所述助溶剂为吐温80、甲醇、乙醇、丙酮和二甲基亚砜中的一种或多种组合。

10.如权利要求8所述的一种醋酸泼尼松的制备方法，其特征在于：所述助溶剂的体积浓度为1％-10％。

技术总结
本发明提出了一种醋酸泼尼松的制备方法，包括如下步骤：S1，扩增谷胱甘肽硫转移酶蛋白基因和3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶KstD基因得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的GTS‑KSTD融合蛋白；S2，构建pET28a‑GTS‑KstD质粒，并将其转化至大肠杆菌BL21中，获得重组菌；重组菌发酵培养，离心后得到重组菌菌泥；S3，醋酸可的松乳化后，加入PMS和步骤S2的重组菌菌泥，转化16‑24h得到醋酸泼尼松。本发明的重组脱氢酶可利用细胞本身的FAD辅酶再生体系，无需添加外源性的辅酶FAD；同时也提高了3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶KstD转化醋酸泼尼松的效率。

技术研发人员：宋龙祥,夏克江,邹振东,系祖斌,李明磊,姚立成
受保护的技术使用者：湖北共同甾体药物研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17