用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及医药，具体是用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒。

背景技术：

1、幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(malt)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(who/iarc)将幽门螺杆菌定为ⅰ类致癌原。

2、幽门螺杆菌的临床检测包括：第一，抽血检测幽门螺杆菌，抽血检查的其实是幽门螺杆菌的抗体，但是即便已经根除幽门螺杆菌，这种抗体也会在血液里存在1-2年的时间，这个时间进行检查，则可能出现假阳性，所以目前医院已很少使用抽血检查幽门螺杆菌的方法，如果哪个医生还建议你抽血检查，那么他一定不够专业。第二，呼气试验，是目前开展最广泛的检测幽门螺杆菌的方法，分为c13和c14呼气试验，都是在服用c13或c14胶囊后检测，不同点是，c14有一定辐射性，而c13没有，相同点是，两者的准确率相当，都可以达到95％以上，因为c14存在辐射性，所以孕妇，儿童检测时，最好选择没有辐射的c13。第三，粪便检测幽门螺杆菌，这是一种新型的检测方法，但目前还没有在临床上广泛开展，幽门螺杆菌也会从胃内脱落，经过肠道排出，所以在大便化验的时候，即可检测幽门螺杆菌，准确率可以达到98％以上，未来有广阔的应用前景。第四，通过胃黏膜活检检测幽门螺杆菌，在进行胃镜检查的时候，医生对胃内病变部位进行黏膜活检，标本在进行he染色的时候，也可以发现是否感染幽门螺杆菌，虽然准确度也比较高，但是不可能广泛推广。

技术实现思路

1、本发明提供了用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒，引物组共有2组，分别针对幽门螺杆菌及其耐药性基因，通过临床样本验证了本发明提供的引物组扩增效率为116.5％和104.5％，对于优化幽门螺杆菌及其耐药性的临床筛查或科学研究，具有重要的意义和应用价值。

2、为达此目的，本发明提供如下的技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供了一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组，包括第一引物组和第二引物组；

4、所述第一引物组包括：正向引物序列seq id no.4、反向引物序列seq id no.5和探针序列seq id no.6；

5、所述第一引物组包括：正向引物序列seq id no.7、反向引物序列seq id no.8和探针序列seq id no.9。

6、引物探针组1：

7、f1(seq id no.4)：tccaaccagatatagccactagca；

8、r1(seq id no.5)：ttacccctttcatcaagcaaatc；

9、p1(seq id no.6)：cacccacatacaaggcttaccgcctg。

10、引物探针组2：

11、f2(seq id no.7)：tcagtgaaattgtagtggaggtgaa；

12、r2(seq id no.8)：aacagaaacatcaagggtggtatcc；

13、p2(seq id no.9)：ctccataagagccaaagcccttact。

14、优选的，在反应体系中，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的浓度均为0.1-1μmol/l。

15、本发明的第二个方面，提供了一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的试剂盒，包括：包括第一引物组和第二引物组；

16、所述第一引物组包括：正向引物序列seq id no.4、反向引物序列seq id no.5和探针序列seq id no.6；

17、所述第一引物组包括：正向引物序列seq id no.7、反向引物序列seq id no.8和探针序列seq id no.9。

18、优选的，还包括5*buffer、mg2+、dntp、taq酶和逆转录体系。

19、优选的，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的初始浓度均为10um。

20、本发明的第三个方面，提供了一种非诊断目的检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的方法，包括以下步骤：

21、s1、提取样本总dna；

22、s2、加入5*buffer、mg2+、dntp、taq酶、逆转录体系、水、正向引物、反向引物和探针，其中，正向引物序列seq id no.3/seq id no.6、反向引物序列seq id no.4/seq id no.7和探针序列seq id no.5/seq id no.8的浓度均为10um；

23、s3、将反应体系进行qpcr扩增。

24、优选的，步骤s2中，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的终浓度均为0.1-1μmol/l。

25、优选的，步骤s3中，qpcr扩增的反应条件为：热盖100-105℃、逆转录40-42℃、预热90-95℃、变性90-95℃、退火55-60℃、延伸70-72℃，变性、退火和延伸共循环40次。

26、优选的，步骤s3中，qpcr扩增的反应条件为：

27、

28、与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：本发明筛选了大量用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组，最终筛选出了扩增效率为116.5％、104.5％，拥有更为标准的扩增曲线、更高的灵敏度和低限检测的引物组。

技术特征：

1.一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组，其特征在于，包括第一引物组和第二引物组；

2.如权利要求1所述的一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组，其特征在于，在反应体系中，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的浓度均为0.1-1μmol/l。

3.一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的试剂盒，其特征在于，包括：包括第一引物组和第二引物组；

4.如权利要求3所述的一种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的试剂盒，其特征在于，还包括5*buffer、mg2+、dntp、taq酶和逆转录体系。

5.如权利要求3所述的种用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的试剂盒，其特征在于，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的初始浓度均为10um。

6.一种非诊断目的检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的一种非诊断目的检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的方法，其特征在于，步骤s2中，正向引物序列、反向引物序列或探针序列的终浓度均为0.1-1μmol/l。

8.如权利要求6所述的一种非诊断目的检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的方法，其特征在于，步骤s3中，qpcr扩增的反应条件为：热盖100-105℃、逆转录40-42℃、预热90-95℃、变性90-95℃、退火55-60℃、延伸70-72℃，变性、退火和延伸共循环40次。

技术总结
本发明公开了用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的引物组及试剂盒，引物组包括第一引物组和第二引物组；所述第一引物组包括：正向引物序列SEQ ID NO.4、反向引物序列SEQ ID NO.5和探针序列SEQ ID NO.6；所述第一引物组包括：正向引物序列SEQ ID NO.7、反向引物序列SEQ ID NO.8和探针序列SEQ ID NO.9；本发明提供了用于检测幽门螺杆菌及其耐药性基因的高效引物组、试剂盒及方法，通过临床样本验证了本发明提供的引物组扩增效率为116.5％和104.5％，对于优化幽门螺杆菌及其耐药性基因的临床筛查或科学研究，具有重要的意义和应用价值。

技术研发人员：谭淼,马小娟,袁青,龙翔
受保护的技术使用者：苏州海苗生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17