一种体外诱导细菌产生耐药性的方法

本技术涉及生物，更具体地说，它涉及一种体外诱导细菌产生耐药性的方法。

背景技术：

1、抗生药物（包括抗生素、消毒剂和防腐剂等）是人类对抗有害微生物的重要武器，但随着各类抗菌药物的广泛使用，微生物出现耐药性的情况越来越普遍。细菌耐药性的出现和蔓延给人和动物疾病的治疗带来了极大困难，引起世界范围内的广泛关注。为了评估某种抗菌药物的使用是否会诱发微生物的耐药性，研究人员常常会进行一系列体外诱导实验，预测该抗菌药物引发耐药性的风险。该类评估实验对于指导研究人员改善药物配方或研发新的抗菌药物具有重要意义。

2、目前做细菌耐药性诱导的方法主要有：1)物理法，如伽马射线诱导、紫外照射，这种诱导方法诱导出来的变异不定向，后续还需要经过进一步的筛选，并且放射剂量不好控制，容易造成细菌死亡，而且对设备、试验条件要求高，对实验人员伤害也大；2)生物法，如基因工程，这种技术能够很大程度的解决变异不定向的问题，但其操作成本高、技术要求高并且操作繁琐；3)传统肉汤传代法和琼脂传代法，基本原理都是逐渐抬高抗菌药物浓度进行连续传代培养，存在不严谨和不便捷的地方，一是每一代传代时接种的菌量无法做到准确定量，仅仅是接种环划一环或者移液枪取多少体积，会有明显的误差，这会导致每一代诱导的实验条件无法做到前后一致；二是肉眼观察存在主观性，无法准确量化评估细菌的实际生长情况；三是对于每一代诱导菌株mic值的检测需要再做额外的实验，实验环节多。

3、针对上述中的相关技术，发明人发现目前的体外诱导细菌产生耐药性的方法较为繁琐，且实验条件不稳定，诱导成功率有待提升。

技术实现思路

1、为了提高体外诱导细菌耐药性实验条件的稳定性，改善诱导成功率和准确率，本技术提供一种体外诱导细菌产生耐药性的方法。

2、第一方面，本技术提供一种体外诱导细菌产生耐药性的方法，采用如下的技术方案：

3、一种体外诱导细菌产生耐药性的方法，包括以下步骤：

4、细菌活化：将菌株从-80℃环境下取出，使用固体平板培养基进行三区划线复苏，在35-37℃下倒置培养16-18h，连续传代培养2次，从固体平板培养基上挑取单菌落于浓度为0.9%的生理盐水中，调节麦氏为0.5，获得原代菌液，将原代菌液稀释20倍，获得菌液，待用；

5、抗菌药物配制和稀释：配制抗菌药物母液，过滤，置于4-5℃下保存待用；使用液体培养基对抗菌药物母液进行二倍比梯度稀释，得到不同浓度的药物溶液，将不同浓度的药物溶液分装到第一代48孔板中，且在第一代48孔板中设置含有液体培养基和所述菌液的阳性对照组和只含有液体培养基的阴性对照组；

6、传代诱导：第一代诱导：分别取100μl所述菌液，加入到含不同浓度药物溶液的第一代48孔板中，在35-39℃下培养14-24h，每隔20min检测每孔的od600值，并确定菌液的mic值；

7、第二代诱导：从诱导后的第一代48孔板中选取od600值≥阳性对照组od600值×10%，且药物浓度最高的孔，取出菌液，调节麦氏为0.5，稀释20倍后，分别取100μl的该菌液加入到装有不同浓度药物溶液的第二代48孔板中，且在第二代48孔板中设置含有液体培养基和所述菌液的阳性对照组和只含有液体培养基的阴性对照组，在35-39℃下培养14-24h，每隔20min检测每孔的od600值，并确定mic值；

8、传代终止：连续传代，直至传代至连续5代mic值稳定不变，传代终止，获得耐药性菌株。

9、通过采用上述技术方案，将菌株经稀释后制成菌液，加入到含有不同浓度药物溶液的48孔板中，经培养后，检测od600值和mic值，然后与阳性对照组的od600值的10%对比，选取od600值大于阳性对照组od600值×10%的菌液，继续进行下一代培养，直至连续5代mic值不变，操作便捷、可严格控制实验变量，实验结果稳定性好、准确性高，可大大提高诱导的效率和成功率，在替代诱导细菌耐药研究方面具有良好的应用价值。

10、可选的，所述传代诱导中，向含不同浓度药物溶液的每一代培养用48孔板中加入的菌液浓度均为5×106cfu/ml。

11、通过采用上述技术方案，使加入48孔板内的菌液浓度相同，能有效控制实验条件的稳定性，改善诱导成功率和准确率。

12、可选的，所述传代诱导中，每一代培养用48孔板中加入菌液后，使菌液最终浓度为5×105cfu/ml，每个孔内的最终物质体积为1ml。

13、通过采用上述技术方案，使48孔板中每个孔内的菌液体积相同，能控制实验条件的稳定性，提高诱导实验的稳定性，改善诱导成功率和准确率。

14、可选的，所述传代诱导中，每一代培养用48孔板中，加入到阳性对照组孔内的菌液和液体培养基的体积比为1:9。

15、通过采用上述技术方案，阳性对照组中菌液由原代菌液稀释20倍制得，每个孔内的最终体积为1ml，那么菌液和液体培养基的体积分别为100μl和900μl，因此48孔板中阳性对照组内，菌液的浓度为5×105cfu/ml。

16、可选的，所述原代菌液的浓度为1×108cfu/ml。

17、通过采用上述技术方案，使用较高浓度的原代菌液，便于稀释，制成特定浓度的待测菌液。

18、可选的，所述抗菌药物母液用0.22μm微孔滤膜进行过滤。

19、通过采用上述技术方案，将抗菌药物母液过滤，去除其中不溶性杂质等，使抗菌药物母液较为纯净。

20、可选的，所述传代诱导中，每一代培养用48孔板中，不同浓度药物在每孔的体积为900μl。

21、通过采用上述技术方案，每一代培养时，48孔内不同浓度药物的体积均相同，易于控制实验条件，降低不确定量对诱导成功率和准确率的影响。

22、可选的，每一代培养用48孔板中，不同浓度的药物溶液为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml。

23、可选的，所述抗菌药物选自抗生素、杀菌剂、消毒剂和防腐剂中的一种。

24、通过采用上述技术方案，抗生素、杀菌剂等抗菌药物能对大多数好样微生物（包括细菌、真菌）等具有较好的杀灭作用，是人类对抗有害微生物的重要武器，因此评估抗菌药物的使用是否会诱发微生物的耐药性是具有重要意义。

25、可选的，所述传代诱导时，将每一代培养用48孔板在37℃下培养，且培养时的转速为800rpm。

26、通过采用上述技术方案，将含有抗菌药物和菌株的48孔板在37℃下培养，使菌株的生长代谢较高，且培养时配合一定转速，能使液相的抗菌药物与菌株充分混合，还能带来流体剪切和微载体碰撞，避免细菌聚团。

27、可选的，所述传代诱导时，从第二代诱导开始，取传至下一代的菌液，进行平板三区划线，观察菌落形态和大小。

28、通过采用上述技术方案，用于进行下一代培养的菌液进行平板三区划线，观察菌落形态或大小是否一致，避免因操作失误而引起污染。

29、综上所述，本技术具有以下有益效果：

30、1、由于不同微生物对于不同抗菌药物产生耐药变异的程度不同，因此本技术中的方法可以快速评估和预测某一抗菌药物未来引发某种细菌产生耐药性的风险，对于指导研究人员改善药物配方或研发新的抗菌药物具有重要意义。

31、2、本技术的方法和流程可以严格控制变量，实验条件稳定性好，结果判定准确性高，可以大大提升耐药诱导的效率和成功率。

32、3、本技术的方法与传统肉汤传代诱导法相比，可以实时监控每一代诱导过程中细菌的实时生长情况，对于分析研究细菌产生耐药性的机制有参考意义。